1 了解蛋白质相互作用的意义 1
详细说明 1
背景 3
参考文献 4
2 信号转导和哺乳动物细胞生长：问题及范例 5
前言 5
信号转导框架 6
蛋白质—蛋白质相互作用和信号转导交叉点的调控 8
信号转导和技术——对未来的一种看法 8
参考文献 9
3 蛋白质相互作用技术对肿瘤生物学与药物遗传学的影响 12
序列变异：肿瘤易感性及基于遗传特异型蛋白相互作用的肿瘤治疗 12
遗传危险因子 13
肿瘤与基因组 13
癌基因 15
原癌基因 15
抑癌基因 16
DNA修复基因 17
药物遗传学：当前的状态与未来的目标 20
抗肿瘤治疗的反应 21
运用蛋白质相互作用研究手段去分析遗传变异的功能意义 22
标签融合蛋白 22
免疫共沉淀 22
酵母双杂交 24
荧光共振能量转移技术 24
表面等离子共振技术 25
原子力显微镜技术 25
参考文献 26
结论 26
前言 32
4 用GST融合蛋白鉴定蛋白质—蛋白质相互作用 32
Far western印迹和pull-down技术的优点 33
替代方法，类似范例 33
程序纲要 33
Far western印迹分析 33
GST沉降分析 35
方案 37
方案1：GST融合蛋白的制备 37
方案2：Far western印迹：标记GST融合蛋白 40
方案3：Far western印迹：探测膜 41
方案4：GST沉降 43
参考文献 45
前言 47
5 通过免疫共沉淀法鉴定相互作用蛋白质 47
已知蛋白质间相互作用的检测 48
新蛋白质间相互作用的鉴定 48
程序纲要 48
细胞裂解与免疫沉淀 49
缔合蛋白的检测 49
优化与对照 50
蛋白质鉴定 51
方案 54
方案1：pVHL结合蛋白Cul2的鉴定 54
致谢 56
参考文献 56
前言 60
6 化学交联技术在研究蛋白质相互作用中的应用 60
体内与体外交联反应的区别 61
交联的步骤 62
蛋白质作为交联反应物的作用 62
pH的影响 63
交联剂的类型 63
交联的特异性及选择性 65
交联的特异性及间距（分子标尺及近邻法） 66
一般步骤 66
交联蛋白的纯化及检测 68
可裂变交联剂 69
标记的交联剂 69
高效液相色谱（HPLC）法分析肽图谱 70
质谱法肽制图 70
交联残基的鉴定 70
亲和检测及交联蛋白的纯化 70
交联多肽的亲和纯化 71
参考文献 71
7 研究蛋白质—蛋白质相互作用的酵母和细菌双杂交筛选系统 74
前言 74
方案 75
第一部分：一种基于转录激活的酵母双杂交系统 75
第二部分：一种基于转录激活的细菌双杂交系统 95
致谢 111
参考文献 111
8 利用噬菌体展示技术研究蛋白质—蛋白质相互作用 113
前言 113
噬菌体展示技术的生物学概论 115
程序纲要 115
噬菌体展示技术潜在的局限性 116
关于设计噬菌体展示文库方法的考虑 117
噬菌体展示技术和模建结构域 118
方案 120
方案1：变异结构域文库的制备 120
致谢 130
参考文献 131
9 在出芽酵母中鉴定蛋白质—蛋白质相互作用的遗传学策略 135
前言 135
为什么使用遗传方法 136
程序纲要 137
抑制基因搜寻的准备 137
抑制基因搜寻的实施 139
抑制基因的分析 140
异源体系 141
方案 141
方案1：诱变 141
方案2：酵母菌总DNA的制备 142
方案3：酵母菌的转化 143
参考文献 143
10 研究蛋白质相互作用的FRET显微成像技术 145
前言 146
GFP：对分子和细胞生物学的影响及在蛋白质相互作用研究中的应用 146
荧光共振能量转移 146
程序纲要 149
FRET检测方法 149
受激发射过程测定 149
频率域FLIM数据分析 154
方案 155
方案1：FRET实验 155
致谢 170
参考文献 171
11 绿色荧光蛋白邻近成像法（GFP-PRIM）检测同型蛋白质间相互作用 174
前言 174
FRET检测同型蛋白质间相互作用 175
GFP-PRIM检测同型蛋白质间相互作用 175
PRIM与FRET的差异 176
方案 176
方案1：体外GFP-PRIM：荧光分光光度法测量激发比率 176
方案2：活细胞GFP-PRIM：同型蛋白质相互作用成像 179
结论 181
参考文献 182
12 质谱表征多元蛋白质复合物 183
前言 183
两个复合物研究例子的背景介绍 184
程序纲要 185
制样与样品导入 185
单个蛋白质及其复合物的质谱 186
单个蛋白质及其复合物的电荷状态 188
复合物中亚基的排布 189
蛋白质复合物的热稳定性探测 189
多元蛋白质复合物的实时组装 190
方案 191
方案1：质谱表征多元蛋白质复合物 191
展望 191
参考文献 192
13 用原子力显微技术检测配体—受体间相互作用 194
前言 194
程序纲要 196
AFM仪器 196
AFM在配体—受体相互作用研究方面的应用 197
方案 198
方案1：悬臂功能基化 198
方案2：固定于琼脂糖珠上的配体的AFM检测 199
方案3：活细胞上的AFM测定 200
致谢 202
参考文献 202
前言 205
14 Biacore表面等离子体共振分析相互作用的蛋白质 205
程序纲要 206
传感器芯片 206
芯片表面的再生 208
数据采集 208
动力学检测 209
浓度测定 210
设计方案 210
方案 211
方案1：Biacore表面等离子体共振使用 211
参考文献 219
15 石英晶体微平衡生物传感器在蛋白质相互作用分析中的应用 221
前言 221
程序纲要 223
方案1：石英晶体微平衡分析 224
方案 224
参考文献 228
16 蛋白酶足迹法 230
前言 230
优点与局限 231
蛋白质水解的类型 233
其他方法 234
程序纲要 235
末端标记 235
复合物的组装 237
蛋白质水解 238
断裂位点的鉴定 240
定量分析 240
方案1：利用蛋白激酶A进行末端标记 241
方案 241
方案2：铁－EDTA蛋白酶足迹法反应 242
方案3：利用酶促蛋白酶进行蛋白质水解 244
方案4：Tricine SDS－聚丙烯酰胺蛋白凝胶 245
方案5：通过溴化氰断裂蛋白质所产生的校准梯形条带 246
方案6：通过酶促断裂产生的校准梯形条带 247
参考文献 248
17 串联亲和纯化提高相互作用蛋白质的识别 250
前言 250
标签的选择与设计 251
程序纲要 253
构建表达TAP标签蛋白的细胞或生物体 254
制备提取物 254
串联亲和纯化 255
方案1：制备用于纯化酵母Lsm3蛋白的提取物 256
方案 256
分析纯化后物质 256
对照与确证 256
方案2：利用TAP方法解析蛋白质相互作用 257
参考文献 260
18 逆转循环纯化蛋白质 262
前言 262
程序纲要 264
总述 264
融合蛋白的构建方案 266
ELP标签和ITC条件的选择 266
方案 267
方案1：将ELP组分融合入靶蛋白 267
方案2：从细胞裂解液中纯化ELP融合蛋白 269
方案3：ELP融合蛋白的一般转移循环 271
结论 272
参考文献 272
19 利用体外表达克隆鉴定相互作用蛋白质 273
前言 273
方案 274
方案1：体外表达克隆 274
参考文献 280
20 用蟾蜍卵提取物修饰重组蛋白 281
前言 281
总则 281
用细胞提取液作为模型系统 282
蟾蜍卵提取物模型系统 283
程序纲要 283
蟾蜍卵提取物的制备 284
重组蛋白的修饰和再分离 285
修饰评价和修饰蛋白的利用 286
对照 288
方案 289
方案1：卵提取 289
方案2：修饰、再分离和评价 291
方案3：质谱 293
致谢 294
参考文献 294
21 采用λ阻遏物融合技术分离和鉴定自组装结构域 297
前言 297
程序纲要 299
文库的构建 300
挑选和筛选 303
自组装结构域的鉴定 305
寡聚化状态的检测 305
方案 306
方案1：λ阻遏物融合 306
致谢 310
参考文献 311
22 基于膜的酵母双杂交体系 314
前言 314
酵母双杂交体系的局限性 315
非传统的酵母双杂交体系——研究膜蛋白相互作用的工具 315
筛选与NubG融合的cDNA库 319
酵母S.cerevisiae膜蛋白相互作用的基因组范围的分析 319
基于膜的酵母双杂交体系应用展望 319
基于膜的酵母双杂交筛选与药物设计 320
基于膜的酵母双杂交体系的优点和缺点 320
致谢 322
参考文献 322
23 β－半乳糖苷酶互补实验对活细胞中蛋白质间相互作用的检测 324
前言 324
背景 325
程序纲要 327
构建和表达融合蛋白的策略 327
检测β-gal活性的方法 329
方案 330
方案1：逆转录病毒的准备与靶细胞的转染 330
方案2：化学发光法检测β-gal的活性 331
方案3：流式细胞法检测β-gal的活性 332
方案4：X-Gal实验检测β-gal的活性 333
方案5：荧光－X-Gal实验检测β-gal的活性 334
参考文献 336
24 双杂交系统研究胞内蛋白质和单链抗体的相互作用 338
前言 338
应用酵母双杂交系统检测胞内单链抗体与抗原相互作用 340
应用酵母双杂交系统筛选单链抗体文库 342
双诱饵酵母双杂交系统一步法鉴定两种不同的单链抗体—抗原相互作用 342
哺乳动物细胞双杂交系统评价单链抗体和蛋白质在胞内的相互作用 345
程序纲要 346
方案 346
方案1：检测单链抗体—蛋白质相互作用的酵母双杂交系统 346
方案2：哺乳动物细胞瞬时转染实验 353
参考文献 354
致谢 354
25 利用蛋白质片段互补策略研究蛋白质相互作用和文库筛选 357
前言 357
程序纲要 359
基本概念 359
DHFR蛋白质片段互补分析（PCA） 360
以新霉素和潮霉素B为基础的PCA 362
TEM β－内酰胺酶PCA 362
PCA研究的控制标准 363
在细菌体内应用DHFR PCA方法库对库筛选相互作用的蛋白质 363
方案 365
方案1：细菌DHFR PCA存活分析 365
方案2：在体内进行库对库的筛选相互作用蛋白质：细菌中进行代谢竞争选择 365
方案3：哺乳动物细胞DHFR PCA存活分析 366
方案4：哺乳动物细胞DHFR PCA荧光分析 367
方案5：GFP PCA荧光分析 369
方案6：体外β－内酰胺酶PCA比色分析 370
方案7：体内β－内酰胺酶PCA酶活分析 371
方案8：新霉素和潮霉素B存活分析 373
参考文献 374
26 基于cAMP信号级联的一种细菌双杂交系统 376
前言 376
以细菌腺苷酸环化酶为基础的双杂交系统原理 377
程序纲要 378
杂合蛋白的表达载体 379
细菌菌株 380
方案1：功能互补的数量测定 381
方案 381
筛选相互作用子 381
试验细菌的转化 381
选择表达相互作用杂合蛋白的细胞 381
结论 384
参考文献 385
27 肽适配子与蛋白质功能和蛋白质网络系统研究 387
前言 387
肽适配子作为表型分析试剂 388
应用酵母双杂交系统选取肽适配子 389
双杂交系统中应用的随机肽库 391
筛选随机肽库的双杂交策略 393
肽适配子获取方法改进 394
调节子和干扰子分析法 396
竞选高效作用的肽适配子 397
参考文献 398
检验肽诱导表型的特异性 398
结论 398
28 用渐增截断方法产生蛋白质片段文库 402
前言 402
程序纲要 403
基本概念 403
渐增截断用载体的描述 405
方案 405
方案1：渐增截断 405
结论 414
参考文献 414
29 蛋白质家族的新成员——催化抗体 416
前言 416
天然催化抗体 417
人工抗体酶的设计和潜能 417
抗体固有催化活性的质量控制标准 419
高催化活性的天然抗体酶的分离 420
抗体酶机制的研究 421
结论 422
参考文献 422
30 通过核糖体展示进行蛋白质—配体相互作用的体外筛选和进化 427
前言 428
核糖体展示的原理 428
核糖体展示的应用 429
程序纲要 430
用于核糖体展示的构建组分 430
核糖体展示构建组分的制备 431
用大肠杆菌S30细胞提取物进行体外翻译 432
体外转录 432
亲和筛选 433
通过适应筛选压力剪切分子 433
从筛选到进化 434
DNA文库和单克隆的RIA分析 434
核糖体展示的优化 435
方案 435
方案1：通过连接制备核糖体展示构建组分 435
方案2：体外转录及mRNA的纯化 437
方案3：大肠杆菌S30细胞提取物的制备 439
方案4：体外翻译 440
方案5：亲和筛选 441
方案6：mRNA的纯化和RT-PCR 443
方案7：进化：引入额外的多样性 445
方案8：核糖体复合物与游离蛋白质及小分子化合物的分离 446
方案9：放射免疫分析（RIA） 446
方案10：Northern印迹 447
参考文献 448
31 用膜上肽合成的方法分析蛋白质相互作用 451
前言 451
相互作用研究的肽合成策略 452
结合反应伴侣的检测 453
程序纲要 453
方案 455
方案1 455
参考文献 459
前言 461
32 蛋白成束增强蛋白质—蛋白质相互作用检测 461
双杂交相互作用 462
双杂交实验存在的问题 462
蛋白成束对双杂交实验灵敏性的加强：应用于哺乳动物细胞 462
杂交蛋白成束在双杂交实验中的优点 464
程序纲要 467
DNA结合结构域和DNA结合结构域融合蛋白 467
激活结构域和激活结构域融合蛋白 467
成束结构域 468
报告基因和报告质粒 468
细胞系 468
对照 469
方法 469
致谢 469
参考文献 469
33 用计算方法分析全基因组蛋白质相互作用 472
前言 473
从基因组到后基因组 473
发现全基因组蛋白质相互作用的问题 473
软方法：纯计算 475
种系发生谱 475
基因簇 477
基因融合 477
中间方法：计算与实验 478
代谢重组 479
转录谱 480
硬方法：纯实验 480
注释（Curated）数据库 480
文本挖掘 481
生物学家的计算资源 482
纯直系同源和种系发生谱 483
基因共定位 483
基因融合分析 485
代谢网络和调控通路 487
基因表达分析方法 490
包含相互作用信息的数据库 491
相互作用蛋白质数据库 491
生物专业数据库 491
参考文献 492
34 蛋白质—蛋白质相互作用的可视化和整合 496
前言 497
为什么需要可视化 497
蛋白质相互作用图与代谢途径 498
蛋白质网络、蛋白质复合物和动态的蛋白质相互作用 498
蛋白质—蛋白质相互作用和相关的信息 499
可视化 500
关系的可视化 500
符号和规则 503
图形和图形的绘制 504
弹簧镶嵌体算法 505
大型图形的局限性 505
扩展到三维空间 505
可视化技术 505
利用补充数据整合蛋白质相互作用网络 508
补充数据类型的同时显示 508
实例：研究半乳糖代谢的整合网络 508
信使RNA和蛋白质表达信息的添加引起的网络改变 509
整合网络拓展了生物学的视野 510
图形描述的选择 512
从可视化描述到一个预测模型：利用物理相互作用网络来进行基因表达建模的早期步骤 513
预测对半乳糖利用网络的某些扰动导致的表达变化 513
将来研究方向 514
参考文献 515
35 通过调节蛋白质—蛋白质之间相互作用发展新的治疗方法 518
前言 518
靶向性转录 518
可诱导的转录 522
病毒载体的重定向 524
总结 525
参考文献 525
附录1 注意事项 531
附录2 供应商 539
索引 540