目录 1
序一 1
序二 1
前言 1
第一章 大肠杆菌、质粒和噬菌体 1
引言 1
第一节 大肠杆菌 5
一、培养基的制备和细菌学工具 5
二、在液体培养基中培养 9
三、在固体培养基中培养 10
四、经典的细菌遗传学选择标志 12
第二节 质粒 24
一、质粒的分子生物学 24
二、质粒DNA的小量制备 31
三、质粒DNA的大量制备 38
四、质粒DNA转化细胞 49
第三节 λ噬菌体及其衍生载体 55
一、λ噬菌体的分子生物学 56
二、λ噬菌体克隆载体 60
三、影印λ噬菌体产生空斑 72
四、λ噬菌体衍生质粒的培养 75
五、从噬菌体裂解物制备λDNA 78
第四节 丝状噬菌体载体 87
一、丝状噬菌体的分子生物学 87
二、M13噬菌体衍生载体的制备与应用 92
第五节 黏粒载体 100
一、黏粒载体简介 100
二、应用黏粒载体构建基因组文库 109
三、黏粒文库的扩增和贮存 118
主要参考文献 125
第二章 DNA的制备与分析 127
引言 127
第一节 DNA溶液的纯化和浓缩 128
第二节 基因组DNA的制备 136
一、从哺乳动物组织中制备基因组DNA 136
二、从植物组织中制备基因组DNA 138
三、细菌基因组DNA的制备 141
第三节 大片段DNA的分离与回收 146
一、琼脂糖凝胶电泳 146
二、脉冲电场凝胶电泳 153
三、用琼脂糖凝胶分离和回收大的DNA片段 160
第四节 DNA小片段的分离与回收 169
一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 169
二、筛分型琼脂糖凝胶电泳 174
第五节 DNA印迹与杂交分析 175
一、Southern印迹 176
二、DNA的斑点印迹和狭线印迹 184
三、DNA印迹的杂交分析 188
第六节 寡核苷酸和DNA片段的纯化 199
一、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸 199
二、羟磷灰石层析法分离双链和单链核苷酸 202
三、阴离子交换层析法纯化DNA 204
主要参考文献 209
第三章 RNA的制备与分析 211
引言 211
第一节 真核细胞和原核细胞RNA的制备 211
一、组织培养细胞胞质RNA的制备 212
二、胍盐法制备总RNA 215
三、植物RNA的制备（酚／SDS法） 221
四、细菌RNA的制备 223
五、带有poly（A）＋RNA的制备 229
第二节 RNA结构分析和合成 231
一、用单链DNA探针和S1核酸酶分析mRNA 232
二、核糖核酸酶保护测定 240
三、引物延伸 246
四、用Northern与狭线印迹杂交分析RNA 248
五、新转录RNA的鉴别 255
主要参考文献 262
第四章 DNA和RNA的酶学操作 263
引言 263
第一节 限制性内切核酸酶 264
一、限制性内切核酸酶的特性 281
二、限制性内切核酸酶消化DNA的方法 281
三、影响酶切效率的主要因素 285
第二节 限制性作图 286
一、多种限制性内切核酸酶消化法作图 287
二、限制性内切核酸酶部分消化法作图 290
三、末端标记法作图 291
第三节 用于修饰与放射性标记核酸的酶 292
一、用于操作核酸的试剂和放射性同位素 293
二、依赖DNA的DNA聚合酶 301
三、不依赖模板的DNA聚合酶 312
四、依赖RNA的DNA聚合酶 313
五、依赖DNA的RNA聚合酶 316
六、不依赖DNA的RNA聚合酶 318
七、磷酸酶和激酶 318
八、外切核酸酶 323
九、内切核酸酶 326
十、核糖核酸酶 330
十一、DNA连接酶 332
十二、RNA连接酶 335
第四节 重组DNA分子的构建 336
一、DNA片段的亚克隆 337
二、PCR构建重组的DNA分子 343
第五节 非同位素探针标记及其应用 347
一、非同位素探针的标记和比色检测 347
二、非同位素探针的化学发光检测 353
主要参考文献 357
第五章 聚合酶链式反应 358
引言 358
第一节 PCR的基本原理 358
第二节 PCR的基本技术 360
一、PCR引物的设计 360
二、模板的制备 362
三、PCR的基本反应 367
四、PCR反应条件的控制与优化 368
五、扩增大片段核酸的PCR条件优化 370
六、PCR实验中应注意的事项 374
第三节 PCR技术的扩展 375
一、多重PCR 375
二、筑巢式PCR 375
三、二次PCR 375
四、中断性PCR 376
五、共享引物PCR 376
六、不对称PCR 376
七、反向PCR 376
八、彩色PCR 377
第四节 用PCR扩增DNA的基本方法 378
一、以DNA为模板扩增DNA 378
二、以mRNA为模板扩增DNA 379
三、筛选最适Mg2＋离子浓度的方案 381
四、方法评注 382
第五节 用PCR定量分析微量DNA 383
一、基本方法 383
二、方法评注 386
第六节 以低丰度RNA为模板扩增cDNA 388
第七节 制备直接用于DNA序列测定的PCR产物 391
一、用不对称PCR制备适合双脱氧测序的单链产物 391
二、用单个引物再扩增制备适合于双脱氧测序的单链模板 392
三、用λ外切核酸酶消化双链PCR产物产生单链的测序模板 393
四、制备用于双脱氧测序的双链PCR产物 394
五、标记PCR产物进行化学测序 395
六、PCR产物的基因组测序法 396
一、连接介导PCR的基本原理 397
第八节 连接介导PCR与基因组足迹分析和测序 397
二、连接介导PCR 399
三、从单层细胞制备基因组DNA进行DMS足迹分析 404
四、从悬浮细胞制备基因组DNA进行DMS足迹分析 408
五、基因组DNA的化学测序反应 409
六、方法评注 411
第九节 用锚式PCR扩增cDNA 414
一、锚式PCR的基本原理 415
二、扩增已知序列的3＇端下游区段（下游锚式PCR） 417
三、扩增已知序列5＇端上游区段（上游锚式PCR） 418
四、方法评注 421
第十节 PCR扩增产物的克隆 422
一、T-A突出端的产生 422
二、利用引物产生半位点 423
三、利用引物引入新的酶切位点 424
第十一节 用PCR差异显示mRNA 425
一、差异显示PCR的基本原理 425
二、差异显示PCR的基本方法 425
三、方法评注 429
主要参考文献 430
第六章 DNA导入哺乳动物细胞 431
引言 431
第一节 DNA转染真核细胞 434
一、磷酸钙转染法 434
二、用DEAE-葡聚糖转染 440
三、用电穿孔转染 445
四、脂质体介导的转染 449
五、基因稳定转入哺乳动物细胞 452
一、融合报道基因概述 457
第二节 DNA转染哺乳动物细胞的检测 457
二、氯霉素乙酰转移酶（CAT）的收获和测定 464
三、萤火虫荧光素酶报道系统分析 469
四、人生长激素报道系统测定 473
五、β-半乳糖苷酶报道系统测定 475
六、转染后RNA的直接分析 476
七、转染方法的优化 477
第三节 用逆转录病毒载体转导基因 480
一、逆转录病毒转导系统概述 480
二、特异逆转录病毒产生细胞株的制备 485
三、逆转录病毒原种的大量制备与浓缩 494
四、逆转录病毒原株中辅助病毒的检测 497
五、体外与体内细胞的逆转录病毒感染 500
主要参考文献 502
一、表达策略 504
第一节 蛋白质在大肠杆菌中的表达 504
第七章 蛋白质的表达 504
引言 504
二、T7噬菌体RNA聚合酶／启动子表达系统 506
三、融合蛋白表达系统 509
四、疑难分析 516
第二节 杆状病毒表达系统 517
一、杆状病毒表达系统的特点和原理 517
二、杆状病毒转移载体 521
三、构建重组病毒的策略 525
四、杆状病毒克隆表达的新策略 528
主要参考文献 534
第一节 蛋白质的光吸收法和生物化学法定量 535
一、紫外光吸收法 535
引言 535
第八章 蛋白质分析 535
二、Lowry氏比色法 536
三、考马斯亮蓝染色法 538
第二节 蛋白质的电泳分离 539
一、蛋白质的一维电泳分离 539
二、蛋白质的二维电泳分离（双相凝胶电泳） 554
三、染色凝胶中蛋白质的电洗脱 560
第三节 蛋白质的检测 562
一、凝胶中蛋白质的染色 563
二、印迹到膜上的蛋白质的检测 568
三、蛋白质的免疫印迹和免疫检测技术 570
第四节 蛋白质的常规层析法纯化 582
一、凝胶过滤层析 582
二、离子交换层析 588
三、免疫亲和层析 592
四、金属鳌合亲和层析 596
第五节 高效液相色谱分离和纯化蛋白质 607
一、反相高效液相色谱 608
二、离子交换高效液相色谱 614
三、体积排阻高效液相色谱 621
四、高效聚焦色谱 625
五、高效疏水作用色谱 629
第六节 用免疫沉淀法纯化蛋白质 632
一、用Sepharose交联抗体免疫共沉淀放射性标记的抗原 633
二、Sepharose偶联抗体的制备 635
三、用抗Ig血清免疫共沉淀放射性标记的抗原 636
四、用抗Ig-Sepharose、A蛋白-／G蛋白-Sepharose或金葡菌菌体免疫共沉淀放射性标记的抗原 637
五、使用强力裂解液和洗涤缓冲液进行免疫共沉淀 637
六、Sepharose交联抗体与未标记抗原的免疫共沉淀 638
七、方法评注 639
第七节 专门应用 639
一、通过克隆基因的转录和翻译在体外合成蛋白质 640
二、蛋白质的生物合成标记技术 643
三、用于微序列分析的蛋白质分离方法 648
主要参考文献 653
第九章 DNA与蛋白质的相互作用 656
引言 656
第一节 哺乳动物细胞核或细胞质内蛋白的提取 659
一、细胞核中提取蛋白质 659
二、细胞质部分的提取 662
三、方法评注 663
第二节 用凝胶电泳进行迁移率改变试验检测DNA结合 665
一、低离子强度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳迁移率改变试验检测法 666
二、高离子强度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳迁移率改变试验检测法 668
三、方法评注 669
第三节 甲基化和尿嘧啶干扰反应分析蛋白质-DNA的作用 671
一、甲基化干扰反应 672
二、尿嘧啶干扰实验 673
三、方法评注 675
第四节 DNase Ⅰ足迹法分析蛋白-DNA结合位点 676
一、DNase Ⅰ足迹分析法 677
二、光密度及数值分析法对蛋白结合滴定进行定量分析 679
三、粗制品的DNase Ⅰ足迹法 681
四、方法评注 682
第五节 蛋白质与核酸的紫外交联反应 682
一、用溴脱氧尿嘧啶核苷替代的探针进行紫外交联反应 683
二、用非溴脱氧尿嘧啶核苷替代的探针进行紫外交联反应 685
三、原位紫外线交联反应 685
四、方法评注 686
第六节 用生物素／链亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白 687
一、基本方案 687
二、用微型柱进行纯化 690
四、方法评注 691
三、用链亲和素-琼脂糖进行纯化 691
第七节 编码DNA结合蛋白cDNA克隆的检测、纯化和鉴定 692
一、用识别位点处的DNA探针筛选λgt11表达文库 692
二、盐酸胍对干燥的影印膜进行反复变性与复性 695
三、从λgt11重组的溶原性细菌的粗提取物鉴定融合蛋白DNA结合活性 696
四、方法评注 697
第八节 滤膜分离游离DNA及与蛋白质结合的DNA 698
一、蛋白质结合DNA的定量测定 698
二、DNA结合特异性的检测 699
三、结合DNA的洗脱 700
四、方法评注 700
第九节 体外合成克隆基因蛋白质分析DNA-蛋白质反应 701
第十节 序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化 703
一、基本方案 703
二、将DNA偶联于溴化氰活化琼脂糖上 706
三、用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸 707
四、DNA亲和层析法 708
五、非同位素竞争性DNA的选择和制备 710
六、方法评注 711
主要参考文献 711
第十章 蛋白质磷酸化的分析 716
引言 716
第一节 磷酸化蛋白质的标记和制备 717
一、32P标记培养细胞 717
二、制备细胞裂解物 719
三、SDS煮沸法裂解细胞 720
四、免疫沉淀法制备分析磷酸化蛋白质 721
第二节 标记的磷酸化蛋白质的检测 722
一、SDS-PAGE检测 722
二、磷酸氨基酸分析 723
第三节 未标记的磷酸化蛋白质的检测 726
一、Western Blot检测未标记的磷酸化蛋白质（ECL法） 726
二、Western Blot检测未标记的磷酸化蛋白质（125I-蛋白A法） 727
第四节 蛋白激酶活性的检测 729
一、合成肽检测蛋白激酶活性 729
二、快速检测蛋白激酶活性 730
第五节 需要特殊仪器的蛋白质磷酸化分析 731
一、毛细管电泳法 732
二、电喷雾质谱法 732
三、HPLC法 732
主要参考文献 732
第十一章 糖复合物的制备与分析 734
引言 734
一、糖复合物分析的概述 734
三、单糖及寡糖的立体化学和图解表示 735
二、技术选择 735
四、术语汇编 738
第一节 糖复合物及其纯化 740
一、糖蛋白及其纯化 741
二、蛋白聚糖、糖胺聚糖及其纯化 748
三、糖脂及其纯化 754
第二节 糖复合物中糖的检测 762
一、动物细胞糖复合物代谢性放射标记 763
二、氧化反应和硼氢化钠还原反应化学标记碳水化合物 772
三、糖基转移酶法分析糖类结构和功能 778
四、蛋白质表面糖磷脂锚的检测 786
五、酚-硫酸测定己糖与戊糖 796
六、N-连接糖基化的抑制 798
第三节 糖复合物中糖的释放 804
一、涎酸酶（唾液酸酶） 805
二、内切性糖苷酶和糖酰胺酶对N-连接寡糖释放 810
主要参考文献 821
第十二章 免疫学技术 823
引言 823
第一节 荧光免疫技术 823
一、荧光标记技术 823
二、荧光免疫测定 825
第二节 酶免疫技术 829
一、酶免疫技术常用的示踪酶及其底物 830
二、酶免疫测定 834
第三节 发光免疫测定技术 844
一、化学发光免疫测定 845
二、生物发光免疫测定 847
第四节 生物素与亲和素标记技术 848
三、电化学发光免疫测定 848
一、生物素与亲和素的生物学特性 849
二、生物素与亲和素标记 850
三、生物素-亲和素试验系统的基本方法 853
主要参考文献 855
第十三章 免疫组织化学和原位杂交技术 857
引言 857
第一节 免疫组化技术的分类 858
一、按标记物分类 858
二、按染色步骤分类 859
第二节 原位杂交技术的分类 861
一、按标记物分类 861
二、按标记方式分类 861
一、培养细胞的免疫荧光染色 862
第四节 常用的免疫组化技术 862
第三节 免疫组化染色和原位杂交技术中的组织处理 862
二、组织切片的免疫荧光染色 865
三、组织石蜡切片的PAP过氧化物酶染色技术 866
四、组织石蜡切片的ABC碱性磷酸酶染色技术 867
五、组织石蜡切片的免疫金银染色技术 869
六、组织石蜡切片的酪酰胺信号放大系统染色技术 871
第五节 原位杂交技术中分子探针的制备 872
一、DNA探针 873
二、RNA探针 875
第六节 常用原位杂交技术 876
一、冰冻切片上的原位杂交技术 876
二、石蜡切片上的原位杂交技术 880
三、原位聚合酶链反应 881
主要参考文献 884
一、基因芯片的概念 885
第一节 基因芯片 885
引言 885
第十四章 生物芯片技术 885
二、基因芯片技术的基本过程 886
三、基因芯片技术的应用 890
第二节 蛋白质芯片 892
一、SELDI技术 892
二、Biacore技术 895
三、构象性蛋白质芯片 896
第三节 组织微阵列 897
第四节 芯片实验室 898
主要参考文献 899
第十五章 细胞培养技术 901
引言 901
第一节 细胞培养的基本概念 901
第二节 细胞培养的类型与细胞生物学 902
一、培养细胞的体内外差异和分化 903
二、培养细胞的形态和分类 903
三、培养细胞的生长和增殖过程 903
四、培养细胞的增殖动力学 904
五、培养细胞的遗传学特征 904
第三节 培养细胞的生存条件 905
一、无污染环境 905
二、温度 905
三、气体环境和氢离子浓度、渗透压 905
四、营养物质 906
五、培养基 907
六、附着底物 907
七、培养用液 907
第四节 细胞培养的常用操作技术 911
一、细胞系的接种和传代 912
二、细胞的洗脱方法 913
三、培养血清的测试 915
四、细胞计数 915
五、细胞活性检测 916
六、细胞的低温冻存和复苏 917
七、培养基的配制 919
第五节 细胞外基质在组织和细胞培养中的作用 920
一、细胞外基质成分及其来源 921
二、细胞外间质的包被 921
三、包被的细胞外基质成分的特征 921
四、在EMC成分上培养的细胞的特异性反应 922
五、三维细胞外基质对细胞培养的细胞特异性反应 923
第六节 培养细胞的生物学污染及其预防检测和排除 924
一、工作环境的无菌 924
三、无菌技术 925
二、器皿的灭菌 925
四、细菌和真菌的污染 926
五、支原体的检测和清除 926
第七节 成纤维细胞的分离与培养 928
第八节 上皮细胞的培养 930
第九节 人毛细血管内皮细胞分离 932
第十节 人淋巴细胞的分离与转化培养 935
第十一节 鼠胚干细胞的体外培养与体外分化 937
一、鼠胚基成纤维细胞的制备和保存 937
二、鼠胚干细胞的培养 938
三、鼠胚干细胞的分化培养 940
四、未分化的鼠胚干细胞的基因转导 941
第十二节 原代神经细胞的分离和培养 944
一、海马锥体神经元的分离和培养 944
二、鸡胚脊根神经细胞的分离和培养 946
第十三节 鸡胚肌母细胞的分离和培养 948
第十四节 新生小鼠心肌细胞的分离和培养 951
第十五节 成年鼠心室肌细胞的分离和培养 953
第十六节 肝星状细胞的培养 957
主要参考文献 958
第十六章 流式细胞术 959
引言 959
第一节 用于流式细胞术检测的单细胞悬液制备 960
一、贴壁培养细胞的单细胞悬液制备 960
二、机械法制备新鲜实体组织的单细胞悬液 960
三、石蜡包埋组织的单细胞悬液制备 961
第二节 非同步化细胞的细胞周期分析 962
第三节 单个细胞细胞周期素的检测 963
第四节 评估肿瘤细胞对化疗药物的耐药性 964
第五节 单细胞内细胞因子产物检测 966
主要参考文献 968
第十七章 细胞凋亡的研究方法 969
引言 969
第一节 细胞凋亡的形态学研究 969
一、普通光学显微镜观察 969
二、倒置显微镜直接观察 971
三、电子显微镜观察 971
四、凋亡细胞的碘化丙锭（PI）排斥分析法 972
第二节 细胞凋亡的生物化学研究方法 973
一、凋亡细胞DNA片段的检测 973
二、细胞群染色体DNA断裂的测定 975
第三节 细胞凋亡的免疫化学分析方法 978
第四节 细胞凋亡的分子生物学研究方法 980
一、过氧化物酶标记测定法 980
二、荧光素标记测定法 982
三、生物素-dUTP／酶标亲和素测定法 983
第五节 流式细胞仪检测凋亡细胞的几种常用方法 984
一、Annexin V法 984
二、TdT法 985
三、F-Actin法 987
四、Caspase-3法 987
五、Sub-G1法 989
主要参考文献 990
第十八章 转基因动物 991
引言 991
第一节 转基因技术的基本原理 991
一、概述 991
二、转基因技术的理论依据 992
第二节 转基因动物常用制备方法 993
一、转基因动物常用制备方法简介 993
二、原核期胚胎的显微注射技术 995
第三节 转基因动物的应用 1005
一、基因表达调控、基因功能及发育调控作用研究 1006
二、基因工程定向育种 1007
三、转基因动物生物反应器研制 1008
四、人类疾病模型与基因治疗 1009
五、药理学研究 1010
六、器官移植 1010
七、环境科学研究 1011
第四节 转基因技术展望 1012
主要参考文献 1013
附录 1016
附录1 细胞分子生物学常用缩写和数据 1016
附录2 实验室常用仪器和设备 1029
附录3 细胞分子生物学常用操作技术 1031
主要参考文献 1043