第一章 常用蛋白质实验技术 1
一、硫酸铵分级沉淀 1
二、相分配法除核酸 2
（一）试剂和贮备溶液 3
（二）从大量蛋白质中除去核酸 3
（三）从核蛋白中提纯蛋白质 4
三、离子交换层析 5
（一）离子交换树脂的处理 5
（二）离子交换层析操作 5
四、蛋白质浓度测定 8
（一）光吸收法 8
（二）双缩脲法 8
（三）劳瑞（Lowry）法 9
（四）劳瑞微量法 9
五、蛋白质溶液的浓缩 10
六、稳定蛋白质的方法 11
七、聚丙烯酰胺凝胶电泳 12
（一）凝胶夹层的组装 12
（二）带浓缩胶的SDS-凝胶电泳 14
（三）尿素-SDS-梯度凝胶电泳 16
（四）凝胶染色 18
（五）荧光显影 18
第二章 常用核酸实验技术 20
一、核酸浓度及纯度测定 20
（一）分光光度法 20
（二）溴乙锭荧光法 20
二、核酸的制备 22
（一）大肠杆菌DNA的制备 22
（二）果蝇DNA的制备 23
（三）果蝇全RNA的制备 25
（四）果蝇rRNA的制备 26
三、DNA的纯化 27
（一）DEAE-纤维素层析 28
（二）HAP吸附层析 29
四、SephadexG-50凝胶过滤 29
（一）SephadexG-50处理 30
（二）常规柱层析法 30
（三）旋转柱层析法 30
五、DNA凝胶电泳 31
（一）琼脂糖凝胶电泳 32
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 35
（三）凝胶染色与摄影 36
（四）从凝胶中洗脱DNA 37
六、核酸浓缩 38
（一）乙醇沉淀 38
（二）丁醇抽提 39
七、核酸沉淀 40
（一）乙醇沉淀 40
（二）三氯乙酸沉淀 40
（三）聚乙二醇沉淀 41
八、DNA的贮存 42
九、三磷酸核苷溶液的配制 42
十、核苷酸纸层析 48
第三章 载体-宿主体系 44
一、质粒 44
（一）质粒载体举例 44
（二）外源DNA克隆 53
二、λ噬菌体 58
（一）溶菌生长途径 59
（二）溶源生长途径 60
（三）λ载体的构建 61
（四）载体选择 61
（五）λ载体图谱 62
三、科斯体 81
四、单股DNA噬菌体 85
第四章 细菌和噬菌体繁殖与贮存 89
一、单菌落分离 89
（一）划线法 89
（二）稀释法 90
（三）涂布法 90
二、细菌的培养与贮存 91
（一）细菌培养 91
（二）细菌贮存 91
三、λ噬菌体的纯化与增殖 92
（一）宿主菌培养 92
（二）噬菌斑形成 92
（三）噬菌斑选取 93
（四）噬菌体制备 93
四、培养基与抗生素 95
（一）液体培养基 95
（二）固体培养基 97
（三）抗生素 97
第五章 载体DNA的制备 99
一、λ噬菌体的大量制备 99
（一）感染法 99
（二）诱导法 100
（三）λ噬菌体的纯化 101
（四）λDNA的提纯 104
二、质粒DNA的大量制备 105
（一）细菌培养与质粒扩增 105
（二）菌体收集与溶菌 106
（三）闭环DNA的提纯 108
（四）RNA的去除 109
第六章 用于基因操作的酶 110
一、限制性内切核酸酶 110
二、甲基化酶 116
（一）dam甲基化酶 116
（二）dcm甲基化酶 117
（三）EcoR工甲基化酶（大肠杆菌）简介 118
三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 119
（一）DNA缺口转移反应 119
（二）DNA聚合酶工（大肠杆菌）简介 121
四、Klenow聚合酶 123
（一）双链DNA 3′-凹端的修补 123
（二）DNA末端的快速标记 124
（三）Klenow酶（大肠杆菌）简介 126
五、T 4 DNA聚合酶 127
（一）DNA末端的快速标记 127
（二）置换合成 128
（三）T4DNA聚合酶（T4感染的大肠杆菌）简介 130
六、T4多核苷酸激酶 131
（一）DNA 5 ′-突端的标记 131
（二）DNA平端或5′-凹端的标记 132
（三）合成接头的标记 133
（四）DNA 5′-突端的标记（交换反应） 134
（五）T4多核苷酸激酶（T4感染的大肠杆菌）简介 135
七、以RNA为模板的DNA聚合酶 136
（一）脱氧寡核苷酸引物的制备 137
（二）杂交探针的制备 138
（三）以RNA为模板的DNA聚合酶（反转录酶）简介 139
八、碱性磷酸酯酶 140
（一）DNA 5′-末端磷酸的去除 141
（二）碱性磷酸酯酶（BAP和CIP）简介 142
九、核酸酶Bal31 142
（一）DNA限制位点作图 143
（二）DNA片段克隆 143
（三）核酸酶Bal31简介 144
十、核酸酶S1 145
十一、绿豆核酸酶 145
十二、核糖核酸酶 146
十三、脱氧核糖核酸酶Ⅰ 146
十四、外切核酸酶Ⅶ 147
十五、外切核酸酶Ⅲ 147
十六、λ外切核酸酶 149
十七、多聚（A）聚合酶 149
十八、T 4 DNA连接酶 150
十九、末端脱氧核苷酸转移酶 151
二十、T 4 RNA连接酶 151
第七章 真核mRNA的制备与分析 152
一、细胞质RNA的制备 153
二、Poly （A）+RNA的纯化 155
三、细胞全RNA的制备 156
（一）胍-热酚法 156
（二）胍-氯化铯法 157
四、RNA凝胶电泳分析 158
（一）乙二醛-二甲亚砜系统 158
（二）甲醛系统 159
（三）氢氧化甲汞系统 161
五、RNA的SI酶定位法 162
第八章 cDNA的合成与克隆 165
一、合成cDNA的技术要点 165
（一）cDNA第一链的合成 165
（二）cDNA第二链的合成 166
（三）发夹环的切割 166
二、克隆双链cDNA的方法 167
（一）用匀聚物接尾 168
（二）用合成接头接尾 169
（三）克隆mRNA·cDNA 170
（四）用寡核苷酸引发cDNA第二链的合成 171
（五）用质粒引发cDNA两条链的合成 171
三、克隆cDNA的谋略 172
（一）丰富mRNA的运用 172
（二）稀有mRNA的运用 173
（三）按分子长度富集mRNA 174
（四）合成寡聚脱氧核苷酸的运用 174
（五）“对比杂交”的运用 175
（六）免疫沉淀法的运用 175
四、合成和克隆cDNA的操作 176
（一）匀聚物接尾法 176
（二）双接头法 184
第九章 重组DNA导入宿主菌 188
一、用质粒DNA转化大肠杆菌 188
（一）用氯化钙提高转化率 188
（二）用氯化钙和氯化铷提高转化率 189
（三）用多种盐提高转化率 190
二、λ噬菌体DNA的体外包装 192
（一）λ噬菌体溶源的贮存与检验 193
（二）包装方法工 194
（三）包装方法Ⅱ 196
第十章 基因文库的组建 199
一、用λ载体组建文库 199
（一）载体DNA的制备 201
（二）真核DNA片段的制备 204
（三）连接与包装 208
（四）文库扩增 212
二、用科斯体组建基因文库 213
（一）用去末端磷酸的科斯体克隆 213
（二）用去磷粘端不同的科斯体克隆 217
（三）科斯体文库的筛选、扩增与贮存 220
第十一章 重组克隆体鉴别 222
一、原位杂交 222
（一）菌落杂交筛选 223
（二）λ噬菌斑杂交筛选 226
（三）核酸分子杂交 228
二、cDNA克隆体的杂交鉴别 231
（一）膜上杂交法 231
（二）溶胞物转译法 238
（三）蛙卵母细胞转译法 240
三、DNA序列的重组鉴别 242
（一）原理 242
（二）实验材料 245
（三）W3110r-m+（p3）的转化 246
（四）用λ文库感染W3110r-m+（p3）（πVX） 246
（五）噬菌体校正基因的遗传学检验 246
（六）πVX系统的检验 247
（七）πVX系统的使用 249
第十二章 重组克隆体分析 250
一、克隆体DNA的快速分离 250
（一）少量质粒DNA的快速分离 250
（二）少量λ噬菌体DNA的快速分离 253
二、限制酶切点定位 254
（一）依次消化法 255
（二）部分消化法 256
三、DNA序列定位 258
（一）SOUTHERN转移 259
（二）膜上杂交 260
四、 DNA片段次级克隆 262
（一）粘端DNA片段次级克隆 62
（二）合成接头的安装 263
（三）补齐5′-突端 263
（四）切除3′-突端 264
（五）合成接头或衔接物安装 265
（六）限制位点的恢复和组建 266
（七）快速克隆 268
第十三章 克隆基因的表达载体 269
一、启动子 269
（一）λ噬菌体PL启动子 270
（二）其它启动子 272
二、核糖体结合位点 272
三、真核基因的表达型载体 273
（一）表达非融合蛋白质的载体 273
（二）表达融合蛋白质的载体 280
四、基因表达的放大 286
五、基因量的扩增 287
六、总结 287
附录Ⅰ常用生物化学技术 289
玻璃和塑料器皿的处理 289
器皿表面的硅化处理 289
有机试剂处理 289
液体培养基 290
凝胶培养基 291
浓缩培养基 291
λ噬菌体用培养基 291
抗生素溶液 292
贮备溶液 292
常用溶液 293
酶液配制 294
限制酶消化用缓冲液 295
常用电泳缓冲液 296
常用凝胶电泳加样缓冲液 296
32P-标记核苷酸处理 297
基因操作中的核酸纯化 297
放射自显影 298
核酸放射性的定量 299
质粒聚合物的制备 300
Maxam-Gilbert序列测定法 300
附录Ⅱ 常用数据 303
商品酸碱浓度和密度 303
限制酶消化反应条件 307
pBR322DNA限制片段长度（bp） 307
λ噬菌体DNA限制片段长度（bp） 308
RNA凝胶电泳分子量标记物 309
三磷酸核苷和脱氧核苷物化常数 310
蛋白水解酶使用和贮存条件 310
附录Ⅲ 常用菌株 311
参考文献 313