第一篇 生物化学与分子生物学实验技术基本理论第一章 生物大分子制备技术 3
第一节 概述 3
一、生物大分子制备的特点 3
二、生物大分子制备的方法和步骤 3
三、生物大分子制备过程中的分析和鉴定 4
四、生物大分子分离纯化的方法 4
第二节 生物大分子制备的前处理 4
一、生物材料的选择 4
二、细胞破碎的方法 5
三、生物大分子的提取 6
第三节 生物大分子的分离纯化 8
一、沉淀 8
二、透析 12
三、超滤 13
四、超临界流体萃取 14
五、萃取与相分离 16
六、结晶 16
七、冰冻干燥 17
八、分离纯化方法的选择 18
第四节 生物大分子样品的保存 18
一、影响生物大分子样品保存的主要因素 18
二、蛋白质和酶等生物大分子样品的保存方法 19
第二章 分光光度技术 21
第一节 基本原理 21
一、光谱 21
二、分子能态 21
三、吸收光谱曲线 22
四、紫外光谱中常用的术语 23
五、光吸收定律 24
第二节 分光光度计的组成、构造和类型 25
一、分光光度计的组成 25
二、分光光度计的构造 25
三、紫外-可见分光光度计的类型 28
四、分光光度法在生物化学和分子生物学实验技术中的应用 28
第三章 电泳技术 30
第一节 基本理论 30
一、电泳发展的历史 30
二、电泳装置 30
三、电泳的基本原理 31
四、影响电泳分离的主要因素 32
第二节 电泳的分类 33
一、电泳的分类 33
二、生物化学和分子生物学实验中常用的电泳 34
第三节 常用电泳支持介质和染色方法 45
一、常用电泳支持介质 45
二、染色方法 46
第四章 离心技术 49
第一节 离心技术基本原理 49
一、离心力 49
二、相对离心力 49
三、沉降系数 50
四、沉降速度 50
五、沉降时间 50
六、相对分子量 50
第二节 离心设备 51
一、离心机的主要类型和构造 51
二、制备性超速离心的分离方法和离心操作的注意事项 53
第五章 层析技术 57
第一节 层析技术概述 57
一、层析技术的发现与发展 57
二、层析技术的应用范围 57
三、层析技术的分类 58
四、层析技术的术语 59
第二节 层析技术基本理论 61
一、分离现象 61
二、塔板理论 62
三、速率理论 63
四、分辨率 64
第三节 吸附层析 65
一、吸附层析的基本原理 65
二、吸附介质的分类及其性质 66
三、吸附层析技术 69
第四节 凝胶层析 71
一、凝胶层析的基本原理 71
二、凝胶层析的基本概念 72
三、凝胶的种类和性质 74
四、凝胶的选择、处理和保存 76
五、凝胶层析的基本操作 77
六、凝胶层析的应用 78
第五节 离子交换层析 79
一、离子交换层析的基本原理 79
二、离子交换剂的种类和性质 80
三、离子交换剂的选择、处理和保存 82
四、离子交换层析的基本操作 83
五、离子交换层析的应用 84
第六节 亲和层析 85
一、亲和层析的基本原理 86
二、亲和吸附剂 86
三、亲和层析的基本操作 90
四、亲和层析的应用 91
第六章 核酸的分离纯化技术 94
第一节 概述 94
一、核酸的理化性质 94
二、DNA提取的几种方法 94
第二节 核酸的分离、纯化和鉴定 95
一、质粒DNA的分离、纯化和鉴定 95
二、基因组DNA的提取 98
三、RNA提取操作中的一般要求 98
四、DNA酶切及凝胶电泳 99
第七章 DNA重组技术 102
第一节 工具酶 103
一、限制性核酸内切酶的概念 103
二、限制性核酸内切酶的命名 104
三、限制性核酸内切酶的分类 104
四、限制性核酸内切酶的作用 104
第二节 基因工程载体 105
一、质粒载体 106
二、噬菌体载体 107
三、动物病毒载体 109
第三节 目的序列与载体的连接 109
一、粘性末端连接 109
二、平末端连接 111
第四节 目的基因序列的来源和分离 111
一、基因组DNA文库 111
二、cDNA文库 112
三、聚合酶链式反应 113
四、人工化学合成 114
第五节 基因序列导入细胞 114
一、转化 114
二、感染 114
三、转染 114
第六节 目的基因序列克隆的筛选与鉴定 115
一、根据重组载体的标志作筛选 115
二、核酸杂交法 115
三、PCR法 116
四、免疫学方法 116
五、DNA限制性内切酶图谱分析 116
六、核苷酸序列测定 116
第七节 克隆基因的表达 116
第八章 分子杂交技术 119
第一节 DNA的变性与复性 119
一、DNA的变性 119
二、DNA的复性 121
第二节 放射性同位素标记核酸探针 122
一、缺口平移法 122
二、末端标记法 122
三、应用特异单引物法标记DNA探针 122
四、双引物法标记DNA探针 122
五、聚合酶链式反应（PCR）标记高活性DNA探针 123
第三节 非放射性标记的核酸探针 123
一、生物素标记核酸探针方法 123
二、光敏生物素标记核酸探针 124
三、生物素-补骨脂素标记法 125
四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰标记化学修饰的DNA法 125
五、缺口平移法标记生物素DNA探针 125
六、生物素随机引物标记探针方法 125
七、异羟基洋地黄毒甙（Digoxigenin）标记核酸探针 126
八、光敏2,4-二硝基苯（光敏DNP）标记DNA法 126
九、三硝基苯磺酸（TNBS）标记核酸探针 126
十、生物素化的RNA探针标记 126
十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法 127
十二、用聚合酶链式反应标记高活性DNA探针 127
第四节 几种常见的核酸分子杂交方法 127
一、Southern杂交 128
二、Northern杂交 129
三、菌落原位杂交 129
四、斑点杂交 129
五、杂交反应的条件及参数的优化 130
第九章 聚合酶链式反应（PCR）技术 131
第一节 PCR技术的原理 131
第二节 PCR反应体系的组成 131
一、PCR反应体系的组成 131
二、电泳分析 133
三、PCR操作范例 133
第三节 影响PCR的主要因素 135
一、温度循环参数 135
二、引物设计 136
三、DNA聚合酶 137
四、影响PCR特异性的因素 139
五、扩增平坡 140
第四节 PCR各种应用模式 140
一、兼并引物PCR 140
二、套式引物PCR 141
三、复合PCR 141
四、反向PCR 141
五、不对称PCR 142
六、标记PCR和彩色PCR 142
七、加端PCR 142
八、锚定PCR或固定PCR 143
九、玻片PCR 143
十、反转录PCR方法检测RNA 143
十一、定量PCR 144
第五节 样品处理与注意事项 145
一、样品处理 145
二、注意事项 146
第六节 PCR仪器的发展 147
第七节 其他链扩增技术及应用范围 148
一、免疫PCR 148
二、转录依赖的扩增系统（TAS） 149
三、再生式序列复制技术 149
四、连接酶链式反应（LCR） 150
五、PCR-SSCP分析技术 150
第十章 DNA序列测定技术 151
第一节 测序原理与策略 151
一、Sanger双脱氧链终止法 151
二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法 154
三、测序策略 154
第二节 非同位素银染测序系统和T7 DNA聚合酶测序技术 157
一、非同位素银染测序系统 157
二、T7 DNA聚合酶测序技术 157
第三节 DNA序列分析的自动化和杂交测序法 158
一、DNA序列分析的自动化 158
二、DNA杂交测序法（SBH） 159
第十一章 生物芯片技术 162
第一节 生物芯片及应用简介 162
一、生物芯片 162
二、应用领域 162
第二节 生物芯片的制作 165
一、点样设备 166
二、芯片片基 167
三、点样样品 168
第三节 图像的采集和分析 176
一、磷感屏成像系统 176
二、荧光芯片扫描仪 177
三、基因芯片上各克隆荧光信号的分析原理 177
四、Microarray数据分析 178
第四节 生物芯片（DNA微阵列）荧光扫描仪中的激光共聚焦扫描技术 179
一、微阵列的相关特性 179
二、微阵列扫描仪 180
三、激光共聚焦扫描仪 182
第二篇 生物化学与分子生物学实验 187
第一章 生物化学实验 187
实验一 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法 187
实验二 粗脂肪的定量测定（Soxhlet提取法） 189
实验三 蛋白质和氨基酸的呈色反应 191
实验四 蛋白质的沉淀、变性反应 196
实验五 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 199
附 pH法测定蛋白质的等电点 205
实验六 Folin-酚法测定血清蛋白质含量 206
附1 双缩脲法测定蛋白质含量 208
附2 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量 209
实验七 紫外吸收法测定蛋白质含量 210
实验八 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 212
实验九 凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 218
实验十 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 223
实验十一 吸附层析法分离制备细胞色素C 229
实验十二 菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定 231
实验十三 定磷法测定核酸浓度 233
附1 RNA的定量测定（苔黑酚法） 237
附2 DNA的定量测定（二苯胺法） 238
实验十四 紫外线（UV）吸收法测定核酸含量 239
实验十五 薄层层析法分离AMP、ADP和ATP 241
实验十六 离子交换柱层析分离核苷酸 243
实验十七 酶的特性 249
实验十八 酯酶同功酶的垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 252
实验十九 超氧化物歧化酶的分离纯化 255
实验二十 亲和层析法纯化胰蛋白酶 259
实验二十一 饱食、饥饿及激素对肝糖原含量的影响 265
第二章 分子生物学实验 268
实验一 植物组织基因组DNA的提取 268
实验二 动物组织基因组DNA的提取 270
实验三 细菌基因组DNA的制备 271
实验四 DNA定量和电泳检测 272
实验五 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 273
实验六 DNA酶切及凝胶电泳 276
实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 279
实验八 动植物组织mRNA提取 281
实验九 植物病毒RNA提取 283
实验十 重组质粒的连接、转化及筛选 284
实验十一 RFLP技术 287
实验十二 RAPD技术 289
实验十三 聚合酶链式反应（PCR） 291
实验十四 Southern杂交 294
实验十五 Northern杂交 296
实验十六 菌落原位杂交 298
实验十七 斑点杂交 300
实验十八 非同位素银染测序系统操作技术 301
实验十九 T7 DNA聚合酶测序技术 308
第三篇 附录 317
附录一 实验室安全及防护知识 317
一、实验室安全知识 317
二、实验室灭火法 318
三、实验室急救 319
附录二 实验室基本操作 319
一、玻璃仪器的清洗 319
二、塑料器皿的清洗 320
三、洗液的配制 320
四、其他洗涤液 320
五、玻璃和塑料器皿的干燥 320
六、移液 320
七、缓冲液与pH值的测定 322
附录三 实验记录与实验报告 324
一、实验记录 324
二、实验报告 325
附录四 实验误差与提高实验准确度的方法 325
一、实验误差 325
二、误差来源 326
三、提高实验准确度的方法 327
附录五 常用酸碱指示剂的配制 327
附录六 常用缓冲溶液的配制方法 328
一、甘氨酸-盐酸缓冲液（0.05mol/L） 328
二、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L） 328
三、邻笨二甲酸氢钾-盐酸缓冲液（0.05mol/L,20℃） 328
四、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 329
五、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液 329
六、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L） 330
七、乙酸-乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,18℃） 330
八、磷酸盐缓冲液 330
九、巴比妥纳-盐酸缓冲液（18℃） 332
十、Tris-盐酸缓冲液（0.05mol/L,25℃） 332
十一、硼砂-硼酸缓冲液（0.2mol/L硼酸根） 332
十二、硼砂-盐酸缓冲液（0.05mol/L硼酸根） 333
十三、硼砂-氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L硼酸根） 333
十四、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（0.1mol/L） 333
附录七 Union Carbide各种型号透析管的渗透范围 334
附录八 Sepctro por再生纤维素膜透析袋数据 334
附录九 纤维素酯膜透析袋的数据 336
附录十 Amicon圆形超滤膜的规格和有效过滤面积的数据 337
附录十一 Amicon圆形超滤膜的流速 337
附录十二 常用蛋白质分子量标准参照物 337
附录十三 凝胶数据表 338
一、Sephadex G型交联葡聚糖凝胶的数据 338
二、Sephadex G型交联葡聚糖凝胶溶胀所需时间 339
三、琼脂糖凝胶的数据 339
四、Superose的数据 340
五、琼脂糖凝胶Bio-Gel A型的数据 340
六、Bio-Gel P型凝胶的数据 341
七、交联聚苯乙烯凝胶Bio-Beads S-X型的数据 341
八、制备级Superdex凝胶过滤介质的数据 342
九、聚乙烯醇型凝胶Toyopearl的数据 342
十、各种凝胶所允许的最大操作压 343
附录十四 凝胶过滤用标准蛋白 344
一、凝胶过滤用低分子质量标准的组成 344
二、凝胶过滤用高分子质量标准的组成 344
三、凝胶过滤用分子质量标准品 344
附录十五 凝胶层析中遇到的故障、原因与排除方法 345
附录十六 薄层层析分离各类物质常用的展层溶剂 346
附录十七 各类物质常用的薄层显色剂 347
附录十八 离子交换纤维素及技术参数 348
一、离子交换纤维素 348
二、交换层析介质的技术数据 348
附录十九 实验室中常用酸碱的比重和浓度 349
附录二十 硫酸铵饱和度的常用表 350
一、调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃） 350
二、调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0℃） 350
附录二十一 常见蛋白质分子量参考值 351
附录二十二 蛋白质等电点参考值 352
附录二十三 离心机转速和离心力的列线计算图 354
一、低速转子的相对离心力列线图 354
二、高速转子的相对离心力列线图 355
附录二十四 分子生物学常用溶液、培养基的配制方法 355
一、常用贮液与溶液 355
二、电泳缓冲液、染料和凝胶加样液 359
三、常用培养基 361
四、常用抗生素 362
参考文献 364