1 基因电子克隆与初步生物信息分析基础实践 1
1.1 实践目的与知识背景 1
1.1.1 实践目的 1
1.1.2 生物信息数据库 1
1.1.3 热休克蛋白90 2
1.2 实践材料与方法 2
1.2.1 生物信息学数据库和软件 2
1.2.2 人类HSP90-β基因的电子克隆步骤 3
1.2.3 人类HSP90-β基因的核酸和蛋白质序列分析 3
1.3 实践结果与分析 3
1.3.1 EST数据库的检索结果 3
1.3.2 人类HSP90-β基因电子克隆 4
1.3.3 人类HSP90-β基因的核酸序列分析 5
1.4 实践体会 8
1.5 小结 8
2 含有某蛋白结构域基因群生物信息学分析实践 10
2.1 实践目的与知识背景 10
2.1.1 实践目的 10
2.1.2 基因本体论 10
2.1.3 Blast2GO 11
2.1.4 Reticulon结构域 11
2.2 实践材料与方法 12
2.2.1 序列获取 12
2.2.2 系统进化树分析 12
2.2.3 Blast2GO功能注释 13
2.2.4 目的基因选取 13
2.2.5 疏水性分析 13
2.2.6 跨膜结构分析 13
2.2.7 结构域功能分析 14
2.2.8 二级结构预测 14
2.2.9 三级结构预测 14
2.3 实践结果与分析 15
2.3.1 水稻中含有Reticulon结构域基因 15
2.3.2 系统进化树 16
2.3.3 Blast2GO功能注释结果与目的基因选取 16
2.3.4 疏水性分析 17
2.3.5 跨膜结构分析 19
2.3.6 结构域分析结果 20
2.3.7 二级结构分析结果 21
2.3.8 三级结构预测结果 22
2.4 实践体会 23
2.4.1 Blast2GO 23
2.4.2 进化树分析 24
2.5 小结 24
3 实时荧光PCR定量分析实践 25
3.1 实践目的与知识背景 25
3.1.1 实践目的 25
3.1.2 水稻概述 26
3.1.3 实时荧光定量PCR技术 26
3.1.4 实时荧光定量PCR技术原理 26
3.1.5 荧光定量PCR中两个重要的概念 28
3.1.6 Ct值与起始模板的关系 28
3.1.7 PCR熔解曲线 29
3.1.8 管家基因的选择 29
3.1.9 双标准曲线法原理 29
3.1.10 本实践技术路线 29
3.2 实践材料与方法 30
3.2.1 主要仪器 30
3.2.2 PCR引物制备 30
3.2.3 cDNA模板的制备 31
3.2.4 质粒构建 32
3.2.5 其他试剂 33
3.2.6 实时PCR扩增体系 33
3.2.7 RQ-PCR扩增曲线条件 34
3.2.8 RQ-PCR熔解曲线条件 35
3.2.9 样本检测 35
3.3 实践结果与分析 36
3.3.1 RNA提取及电泳鉴定 36
3.3.2 引物筛选结果 36
3.3.3 Mg2＋优化 39
3.3.4 双标准曲线的制作 40
3.3.5 水稻基因LOC_Os01g45914时空表达情况 42
3.4 实践体会 46
3.4.1 实时定量PCR技术的优点 46
3.4.2 降落PCR 47
3.4.3 参照基因eEF-1α 47
3.4.4 PCR反应体系条件优化 48
3.4.5 结论 50
3.4.6 展望 50
3.5 小结 50
4 实时荧光COLD-PCR检测点突变实践 51
4.1 实践目的与知识背景 51
4.1.1 实践目的 51
4.1.2 白血病概述 52
4.1.3 白血病发病机理 53
4.1.4 白血病分子遗传学 53
4.1.5 微小残留白血病及其检测 54
4.1.6 基因突变的研究背景 55
4.1.7 COLD-PCR技术 57
4.1.8 COLD-PCR技术的应用 59
4.1.9 其他PCR技术 59
4.2 实践材料与方法 61
4.2.1 实验仪器 61
4.2.2 主要材料 61
4.2.3 其他试剂 62
4.2.4 染料法测定野生型、突变型熔点 62
4.2.5 非COLD-PCR反应体系和反应程序的建立 63
4.2.6 FAST-COLD-PCR反应体系和反应程序的建立 64
4.2.7 灵敏度分析的模板准备 65
4.3 实践结果与分析 65
4.3.1 反应体系优化 65
4.3.2 Mg2＋浓度的优化 65
4.3.3 不对称比例优化 66
4.3.4 探针浓度优化 67
4.3.5 灵敏度考察 68
4.3.6 COLD-PCR程序的建立与优化 69
4.3.7 COLD-PCR程序初步优化 70
4.3.8 COLD-PCR程序再次优化 72
4.3.9 COLD-PCR稳定性重复实践 74
4.3.10 COLD-PCR灵敏度 77
4.4 实践体会 77
4.4.1 COLD-PCR技术的优点 77
4.4.2 利用探针熔解曲线来检测突变的优缺点 78
4.4.3 结论 80
4.4.4 展望 80
4.5 小结 80
5 抗体金标记检测试纸制备与鉴定实践 81
5.1 实践目的与知识背景 81
5.1.1 实践目的 81
5.1.2 黄曲霉毒素 81
5.1.3 胶体金免疫层析技术 82
5.1.4 胶体金免疫层析技术的应用 83
5.2 实践材料与方法 84
5.2.1 实践材料 84
5.2.2 实践仪器 84
5.2.3 实践方法 84
5.3 实践结果与分析 86
5.3.1 胶体金的紫外扫描鉴定 86
5.3.2 试纸条灵敏度、特异性及其检测范围 87
5.3.3 油脂样品的检测 88
5.3.4 假阳性、假阴性的测定 88
5.3.5 免疫层析试纸条的重现性 89
5.3.6 免疫层析试纸条的稳定性 89
5.4 实践体会 89
5.4.1 结论 89
5.4.2 改进 89
5.5 小结 90
6 基因芯片技术基础实践 91
6.1 实践目的与知识背景 91
6.1.1 实践目的 91
6.1.2 生物芯片简介 91
6.1.3 基因芯片制作方法 92
6.1.4 基因芯片改性技术简介 92
6.1.5 聚乳酸材料简介 94
6.1.6 显色方法简介 94
6.2 实践材料与方法 94
6.2.1 仪器 94
6.2.2 试剂 95
6.2.3 溶液配制 96
6.2.4 聚乳酸片 96
6.2.5 DNA片段 97
6.2.6 实践方法 97
6.3 实践结果与分析 100
6.3.1 ARF8基因扩增产物电泳图 100
6.3.2 PLA芯片硅烷化前后比较图 100
6.3.3 PLA芯片结果示意图 101
6.4 实践体会 101
6.4.1 结论 101
6.4.2 改进 101
6.5 小结 102
7 高效液相色谱—串联质谱实践 103
7.1 实践目的与知识背景 103
7.1.1 实践目的 103
7.1.2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂 103
7.1.3 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂检测方法发展现状 103
7.1.4 检测方法的选择与建立 104
7.1.5 本章实践主要过程 106
7.2 实践材料与方法 107
7.2.1 实践材料 107
7.2.2 实践试剂 107
7.2.3 实践仪器 107
7.2.4 农药标准溶液配制 108
7.2.5 样品处理 108
7.3 实践结果与分析 108
7.3.1 标准溶液色谱 108
7.3.2 检测方法的选择与建立 109
7.3.3 定性筛查 109
7.3.4 定量分析与方法科学性验证 111
7.3.5 方法精确度和准确度 111
7.3.6 实际样品的测定 112
7.4 实践体会 113
7.5 小结 114
8 CRISPR/CAS载体构建与转染实践 115
8.1 实践目的与知识背景 115
8.1.1 实践目的 115
8.1.2 CRISPR/CAS系统概述 115
8.1.3 CRISPR/CAS系统的广泛分布和分类 115
8.1.4 hCdc6基因与结肠癌的发生 116
8.2 实践材料与方法 117
8.2.1 实践材料 117
8.2.2 实践方法 117
8.3 实践结果与分析 128
8.3.1 目的载体PKS-hCdc6-target-A（flag/3flag）的构建 128
8.3.2 PKS-hCdc6-C-target-final-flag/3flag载体构建 130
8.3.3 目的载体与辅助载体的共转染与新型细胞系的筛选 131
8.4 实践体会 132
8.4.1 CRISPR/CAS系统介导的免疫机理 132
8.4.2 影响小提中量质粒纯度的因素 133
8.4.3 影响质粒转染效率的因素 134
8.4.4 影响细胞传代效率的因素 134
8.4.5 结论 135
8.4.6 展望 135
8.5 小结 135
参考文献 137