第1章 绪论 1
1.1 基因工程的基本概念 1
1.2 基因工程的理论和技术 1
1.2.1 基因工程所依赖的核心理论 1
1.2.2 基因工程所依赖的核心技术 2
1.3 基因工程的建立与发展 2
1.3.1 基因工程的建立 2
1.3.2 基因工程的发展 3
1.4 基因工程的产业化及应用 6
1.4.1 产业化 6
1.4.2 基因工程的应用 7
1.5 转基因生物的安全性与伦理 9
1.5.1 转基因生物的安全性 9
1.5.2 转基因生物的伦理 11
1.6 应用事例 12
1.6.1 问题的提出 12
1.6.2 生化产品生产中存在的问题 12
1.6.3 基因工程的用途 13
1.6.4 实例 13
第2章 基因 14
2.1 “遗传因子”——生物性状遗传的符号 14
2.2 基因——位于染色体上的遗传功能单位 14
2.2.1 等位基因 14
2.2.2 复等位基因 15
2.3 顺反子——一个基因一条多肽 17
2.4 操纵子——遗传信息传递和表达的统一体 18
2.5 超基因 20
2.6 假基因 21
2.7 断裂基因 22
2.7.1 RNA剪接 22
2.7.2 内含子的类型 24
2.8 重叠基因 27
2.9 可动基因 29
2.9.1 Ac-Ds系统 29
2.9.2 插入序列 29
2.9.3 转座子 31
2.9.4 P因子 34
2.9.5 反转录转座子 35
2.10 癌基因和抑癌基因 36
2.11 染色体外基因 37
2.11.1 质粒 37
2.11.2 线粒体基因 37
2.11.3 叶绿体基因 39
2.11.4 非孟德尔遗传 39
第3章 工具酶 41
3.1 限制性核酸内切酶 41
3.1.1 宿主的限制和修饰现象 41
3.1.2 限制性核酸内切酶的类型 42
3.1.3 限制性核酸内切酶的命名 46
3.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素 46
3.1.5 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 48
3.1.6 限制性核酸内切酶反应的终止 49
3.1.7 限制性核酸内切酶酶切反应的操作步骤和注意事项 49
3.2 DNA聚合酶 50
3.2.1 DNA聚合酶Ⅰ（E.coli） 51
3.2.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段 52
3.2.3 T4DNA聚合酶 52
3.2.4 依赖于RNA的DNA聚合酶 53
3.2.5 T7DNA聚合酶 53
3.2.6 修饰的T7DNA聚合酶 53
3.3 DNA连接酶 54
3.3.1 大肠杆菌和T4噬菌体的DNA连接酶 54
3.3.2 影响连接反应的因素 55
3.3.3 DNA片段在体内和体外的连接——黏性末端的连接 55
3.3.4 平齐末端的连接 57
3.3.5 连接反应的注意事项 59
3.4 DNA及RNA的修饰酶 59
3.4.1 末端脱氧核苷酸转移酶 59
3.4.2 T4多核苷酸激酶 60
3.4.3 碱性磷酸酶 61
3.5 核酸外切酶 61
3.5.1 核酸外切酶Ⅶ 62
3.5.2 核酸外切酶Ⅲ 62
3.5.3 λ核酸外切酶和T7基因6核酸外切酶 63
3.6 单链核酸内切酶 63
3.6.1 S1核酸酶 63
3.6.2 Ba131核酸酶 64
3.7 细胞裂解酶 65
3.7.1 溶菌酶 65
3.7.2 蛋白酶K 65
3.7.3 纤维素酶 65
3.7.4 其他裂解酶 66
3.8 其他 66
3.8.1 琼脂糖酶 66
3.8.2 核酸酶抑制剂 66
第4章 载体 67
4.1 质粒载体 67
4.1.1 质粒的一般生物学特性 67
4.1.2 质粒载体的选择 71
4.1.3 常用的大肠杆菌质粒载体 72
4.2 噬菌体载体 79
4.2.1 单链噬菌体载体 80
4.2.2 双链噬菌体载体 83
4.3 柯斯质粒载体 89
4.3.1 柯斯质粒载体的组成 89
4.3.2 柯斯质粒载体的特点 89
4.3.3 柯斯质粒载体的应用 90
4.4 噬菌粒载体 91
4.4.1 噬菌粒载体的概念 91
4.4.2 pUC118和pUC119噬菌粒载体 92
4.4.3 pBluescript噬菌粒载体 92
4.5 人工染色体载体 93
4.5.1 酵母人工染色体载体 93
4.5.2 细菌人工染色体载体 95
4.5.3 P1人工染色体载体 96
第5章 重组DNA分子的转化与重组子筛选 98
5.1 DNA分子的转化与扩增 98
5.1.1 DNA重组转化的基本概念 98
5.1.2 受体细胞的选择 99
5.1.3 转化方法 101
5.1.4 转化率及其影响因素 104
5.1.5 转化细胞的扩增 105
5.1.6 进行转化时的注意事项 105
5.2 重组体克隆的筛选与鉴定 105
5.2.1 遗传检测法 106
5.2.2 物理检测法 110
5.2.3 核酸杂交法 112
5.2.4 PCR检测法 115
5.2.5 克隆基因定位法 115
5.2.6 测序检测法 117
5.2.7 外源基因表达产物检测法 117
第6章 大肠杆菌基因工程 120
6.1 外源基因在大肠杆菌高效表达的原理 120
6.1.1 启动子 120
6.1.2 终止子 125
6.1.3 核糖体结合位点 126
6.1.4 密码子 127
6.1.5 质粒拷贝数 128
6.2 大肠杆菌工程菌的构建策略 130
6.2.1 包涵体型异源蛋白的表达 130
6.2.2 分泌型异源蛋白的表达 133
6.2.3 融合型异源蛋白的表达 135
6.2.4 寡聚型异源蛋白的表达 138
6.2.5 整合型异源蛋白的表达 142
6.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 143
6.3 重组异源蛋白的体外复性活化 145
6.3.1 蛋白质变性的动力学原理 145
6.3.2 折叠中间状态分子的集聚作用 146
6.3.3 包涵体的溶解与变性 147
6.3.4 异源蛋白的复性与重折叠 149
6.4 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 154
6.4.1 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 155
6.4.2 改善基因工程菌不稳定性的策略 156
6.5 大肠杆菌基因工程的案例 158
第7章 酵母菌基因工程 163
7.1 酵母菌的宿主系统 163
7.1.1 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 163
7.1.2 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 164
7.1.3 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 164
7.1.4 内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌 165
7.2 酵母菌的载体系统 166
7.2.1 酿酒酵母的2μ环状质粒 166
7.2.2 乳酸克鲁维酵母的线型质粒 167
7.2.3 果蝇克鲁维酵母的环状质粒 168
7.2.4 含ARS的YRp和YEp 169
7.2.5 含CEN的YCp 169
7.2.6 穿梭载体 170
7.3 酵母菌的转化系统 171
7.3.1 酵母菌的转化程序 172
7.3.2 转化质粒在酵母细胞中的命运 172
7.3.3 用于转化子筛选的标记基因 173
7.4 酵母菌的表达系统 175
7.4.1 酵母菌启动子的基本特征与选择 175
7.4.2 酵母菌启动子的可调控表达系统 176
7.4.3 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 178
7.4.4 酵母菌表达系统的选择 178
7.5 酵母菌基因工程的案例 180
第8章 核酸的分离纯化与目的基因的克隆 184
8.1 核酸的分离纯化 184
8.1.1 核酸分离提取的原则 184
8.1.2 核酸的分离提取 185
8.1.3 质粒DNA的提取 188
8.1.4 RNA的提取 189
8.1.5 核酸的检测 190
8.2 目的基因的克隆 192
8.2.1 鸟枪法 192
8.2.2 cDNA法 195
8.2.3 PCR扩增法 198
8.2.4 化学合成法 208
8.2.5 基因文库的构建 210
第9章 基因组 214
9.1 基因组剖析 214
9.1.1 基因组序列复杂性 214
9.1.2 原核生物基因组 216
9.1.3 真核生物基因组 220
9.2 基因组测序 227
9.2.1 DNA测序方法 227
9.2.2 基因组测序 234
9.2.3 序列组装 236
9.3 基因组序列注释 239
9.3.1 搜寻基因 239
9.3.2 基因注释 246
9.3.3 基因功能检测 248
9.3.4 高通量基因功能研究方法 249
9.4 功能基因组学 251
9.4.1 组学简介 251
9.4.2 转录物组 251
9.4.3 蛋白质组 252
9.4.4 基因本体 253
9.5 基因组表观遗传 256
9.5.1 什么是表观遗传 256
9.5.2 位置效应 258
9.5.3 DNA甲基化 259
9.5.4 染色体重建 259
9.6 基因组编辑 260
9.6.1 遗传重组 260
9.6.2 基因敲除 265
9.6.3 新一代的基因组定点编辑技术 269
第10章 蛋白质工程 282
10.1 蛋白质工程的基本概念 282
10.1.1 蛋白质工程的基本特征 282
10.1.2 蛋白质工程的研究内容和应用 283
10.1.3 蛋白质工程实施的必要条件 283
10.2 基因的体外定向突变 284
10.2.1 局部随机掺入法 284
10.2.2 碱基定点转换法 285
10.2.3 部分片段合成法 286
10.2.4 引物定点引入法 287
10.2.5 PCR扩增突变法 289
10.3 基因的体外定向进化 290
10.3.1 易错PCR 291
10.3.2 DNA改组 291
10.3.3 体外随机引发重组 291
10.3.4 交错延伸 292
10.3.5 过渡模板随机嵌合生长 292
10.3.6 渐增切割杂合酶生成 294
10.3.7 同源序列非依赖性蛋白质重组 295
10.3.8 突变文库的筛选模型 296
10.4 蛋白质工程的设计思想与应用 297
10.4.1 提高蛋白质或酶的稳定性 297
10.4.2 减少重组多肽链的错误折叠 297
10.4.3 改善酶的催化活性 297
10.4.4 消除酶的被抑制特性 297
10.4.5 修饰酶的催化特异性 298
10.4.6 强化配体与其受体的亲和性 298
第11章 途径工程 299
11.1 途径工程的基本概念 299
11.1.1 途径工程的基本定义 299
11.1.2 途径工程的基本过程 300
11.1.3 途径工程的基本原理 302
11.2 途径工程的研究战略 303
11.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流 303
11.2.2 在现存途径中改变物质流的性质 304
11.2.3 利用已有途径构建新的代谢旁路 305
11.3 初级代谢的途径工程 305
11.3.1 发酵生产乙醇的基本战略 306
11.3.2 酵母菌属乙醇发酵途径的改良 308
11.3.3 高产乙醇的重组大肠杆菌的构建 309
11.3.4 直接利用太阳能合成乙醇的光合细菌途径设计 311
11.4 次级代谢的途径工程 312
11.4.1 提高次级代谢产物的手段 312
11.4.2 红霉素（聚酮类抗生素）的生物合成 313
11.4.3 提高红霉素A产量的策略 315
附录 318
参考文献 336