第一篇 基因工程基础 1
第一章 基因工程概况 1
第一节 基因与基因工程 1
一、基因的概念 1
二、基因工程的概念 3
三、基因工程的操作流程 4
四、人类基因组计划 5
第二节 基因工程的发展与意义 7
一、基因工程的发展 7
二、基因工程的研究意义 10
参考文献 11
第二章 核酸操作技术 12
第一节 核酸操作的基本原理 12
一、DNA双螺旋的变性与复性 13
二、基因操作的工具 15
第二节 DNA和RNA的分离提取 17
一、DNA的提取 17
二、RNA的提取 20
第三节 核酸标记 20
一、末端标记 21
二、缺口平移 21
三、引物原位标记法 22
第四节 核酸的处理、定量与保存 23
一、核酸的分离纯化 23
二、凝胶电泳法分离核酸 23
三、核酸的定量和保存 24
参考文献 24
第三章 工具酶 26
第一节 限制性内切核酸酶 26
一、限制性内切核酸酶的发现 26
二、限制性内切核酸酶的命名方法 27
三、限制性内切核酸酶的识别特点 27
四、限制性内切核酸酶的切割方式 28
五、内切酶星号活性 30
六、内切酶反应的影响因素 30
第二节 其他常用工具酶 34
一、DNA连接酶 34
二、DNA聚合酶 36
三、修饰性工具酶 40
参考文献 42
第二篇 基因工程操作方法 43
第四章 载体与宿主系统 43
第一节 载体的种类 44
一、质粒载体 44
二、噬菌体载体 48
三、动物细胞载体 55
第二节 宿主系统 56
一、原核宿主 57
二、真核宿主 57
参考文献 58
第五章 DNA的克隆策略 59
第一节 化学法合成DNA 59
一、短片段直接连接法组装DNA 60
二、长片段部分重叠法组装DNA 60
第二节 构建文库法克隆基因 61
一、构建基因组文库克隆目的基因 61
二、构建cDNA文库克隆目的基因 63
第三节 依据特定的DNA序列或表达产物特性克隆基因 66
一、用核酸探针筛选目的DNA 66
二、用寡核苷酸探针筛选目的DNA 66
三、表达序列标签（EST）法筛选目的DNA 67
四、转座子标签法克隆DNA 67
五、依据表达产物特性筛选目的DNA 67
第四节 基于mRNA反转录的差异的基因分离 68
一、RACE方法分离基因 68
二、差异杂交筛选目的DNA 69
三、mRNA差异显示技术 70
四、代表性差别分析法分离目的基因 71
五、抑制差减杂交法分离目的基因 72
第五节 DNA微阵列法分离基因 74
一、DNA微阵列的分类 74
二、DNA微阵列法分离基因的原理 74
参考文献 75
第六章 聚合酶链反应（PCR） 77
第一节 概述 77
一、PCR反应中的主要成分 78
二、PCR反应过程 79
三、PCR产物的克隆 80
第二节 影响PCR的主要因素 80
一、循环温度设计 81
二、引物设计 82
三、DNA聚合酶 82
四、扩增平台期 84
第三节 PCR反应的应用模式 84
一、兼并引物PCR 84
二、套式引物PCR 85
三、复合PCR 85
四、反向PCR 86
五、不对称PCR 86
六、加端PCR 87
七、锚定PCR 87
八、玻片PCR 87
九、标记PCR和彩色PCR 88
十、反转录PCR 88
十一、定量PCR 89
参考文献 89
第七章 DNA序列分析 91
第一节 传统的DNA测序方法 91
一、Sanger双脱氧链终止法 91
二、Maxam-Gilbert化学降解法 94
第二节 DNA的自动化测序 97
一、DNA自动化测序的基本原理 98
二、DNA自动测序的步骤 98
三、DNA自动分析仪 98
第三节 DNA测序策略 100
一、定向测序策略 100
二、随机测序策略 101
三、多路测序策略 101
四、引物步移测序策略 101
第四节 新一代测序仪 101
一、SOLiD测序仪 103
二、454测序仪 103
三、Solexa高通量测序仪 105
四、HeliScope测序仪 105
五、新型纳米孔测序技术 106
六、新一代测序技术的前景 106
第五节 其他DNA测序技术 106
一、质谱法 106
二、杂交测序法 107
三、原子探针显微镜测序法 107
四、流式细胞仪测序法 108
五、超薄水平凝胶电泳测序法 108
参考文献 108
第八章 重组子的筛选 110
第一节 载体表型选择法 110
一、抗药性标记及其插入失活选择法 110
二、β-半乳糖苷酶显色反应选择法 113
三、噬菌斑筛选法 114
第二节 根据插入基因的表型选择 114
第三节 DNA电泳检测法 114
一、快速裂解菌落鉴定法 115
二、酶切电泳筛选法 115
三、PCR扩增检测法 117
第四节 核酸杂交检测法 118
一、核酸探针 118
二、核酸杂交检测方法 120
三、DNA-蛋白质筛选法 125
第五节 免疫化学检测法 125
一、放射性抗体测定法 125
二、免疫沉淀测定法 126
三、酶联免疫吸附测定法 127
四、免疫印迹 131
第六节 转译筛选法 132
一、无细胞翻译系统 132
二、转译筛选 133
第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 134
一、利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 134
二、利用报告基因筛选植物转化细胞 136
参考文献 138
第九章 目的基因在受体细胞中的表达 139
第一节 目的基因表达的条件 139
一、启动子与转录起始 139
二、rnRNA的有效延伸和转录终止 139
三、mRNA的稳定性 140
四、有效的翻译起始 140
五、遗传密码应用的偏倚性 141
六、mRNA的二级结构 141
七、RNA的加工 141
八、mRNA序列上终止密码子的选择 141
九、表达质粒的拷贝数及稳定性 142
十、外源蛋白的稳定性 142
十一、减少基因沉默 142
第二节 目的基因在大肠杆菌细胞中的表达 142
一、大肠杆菌表达系统的优缺点 143
二、大肠杆菌表达载体的构成 143
三、目的基因在大肠杆菌中的表达形式 145
四、影响目的基因表达的因素 148
五、pET系统 149
第三节 目的基因在酵母中的表达 150
一、酵母系统的生物学特性 150
二、酵母表达系统的组成 150
三、酵母表达载体的类型和宿主菌 151
第四节 目的基因在昆虫细胞中的表达 154
一、昆虫表达系统的优势 154
二、昆虫表达系统的构成 155
三、重组病毒载体的筛选和改进 156
四、外源基因在BEVS中的表达水平及影响因素 157
五、杆状病毒表达系统的缺点 158
六、家蚕生物反应器 158
第五节 目的基因在哺乳动物细胞中的表达 159
一、哺乳动物细胞的表达载体 159
二、哺乳动物宿主细胞 161
三、提高哺乳动物细胞表达的策略 162
参考文献 163
第三篇 基因工程应用技术 165
第十章 目的蛋白的纯化与分析 165
第一节 目的蛋白的分离纯化 165
一、离心法 166
二、沉淀法 168
三、膜分离 171
四、电泳法 174
五、色谱法 179
第二节 目的蛋白的分析 184
一、紫外-可见分光光度法 185
二、HPLC法和CE法 187
三、质谱法 188
参考文献 190
第十一章 基因操作技术在医学与法医学上的应用 191
第一节 基因治疗 191
一、基因治疗的概念和策略 191
二、基因治疗的基本过程 192
三、基因治疗的临床应用研究 194
第二节 基因诊断 195
一、基因诊断的概念及特点 196
二、基因诊断的主要技术方法 196
三、基因诊断的应用 197
第三节 基因工程制药 198
一、基因工程药物的分类 198
二、基因工程药物的发展 200
三、基因工程药物产业化状况 201
参考文献 202
第十二章转基因生物 203
第一节 转基因动物 203
一、转基因动物技术的基本原理 204
二、常用转基因动物的方法 205
三、转基因动物的检测 209
四、转基因动物的应用 209
五、转基因动物研究中存在的问题与展望 213
第二节 转基因植物 214
一、转基因植物技术的基本原理 214
二、植物转基因的常用方法 215
三、转基因植物的筛选与检测 216
四、转基因植物的应用 216
第三节 转基因生物食品 220
一、转基因食品分类 221
二、转基因食品的发展状况 222
参考文献 222
第十三章 基因工程的安全性与发展前景 224
第一节 基因工程的安全性 224
一、转基因生物的安全性 224
二、与基因工程产品安全性有关的重要事件 226
三、生物安全政策、法规与风险评估 228
四、转基因生物与国际贸易和社会经济问题 230
五、转基因生物的社会伦理问题 231
第二节 基因工程的发展前景 233
一、基因工程在农业中应用的发展前景 233
二、基因工程在生物医药中应用的发展前景 235
三、基因工程在工业中应用的发展前景 236
四、基因工程在其他领域中应用的发展前景 237
参考文献 239