上篇 慢病毒分子生物学 3
第一章 反转录病毒 3
第一节 反转录病毒的分类与进化 3
一、反转录病毒的分类 3
二、反转录病毒的进化关系 5
第二节 反转录病毒的结构 6
一、病毒颗粒的超微结构 6
二、病毒基因组的结构 7
第三节 反转录病毒的生活周期 9
一、反转录病毒的进入和脱衣壳 9
二、反转录 11
三、整合 12
四、病毒RNA和蛋白质的合成及加工 13
（一）病毒基因组RNA及mRNA的产生 15
（二）病毒蛋白的合成及加工 15
五、病毒颗粒的装配、释放和成熟 18
第四节 反转录病毒基因表达与调控 19
一、反转录病毒转录的启动子 19
二、反转录病毒转录水平的调控 20
三、转录后水平的调控 20
四、翻译水平的调控 21
五、翻译后水平的调控 22
六、宿主抗反转录病毒因子 22
第五节 反转录病毒引发的疾病 23
一、复制型反转录病毒引起的疾病 24
（一）插入激活导致的白血病 24
（二）病毒致病性因子 25
二、其他反转录病毒引起的疾病 25
参考文献 25
第二章 人免疫缺陷病毒及动物慢病毒概述 31
第一节 人免疫缺陷病毒 31
一、人免疫缺陷病毒的结构 32
（一）毒粒结构 32
（二）基因组结构 33
（三）基因亚型 34
二、人免疫缺陷病毒的生活周期 35
三、人免疫缺陷病毒的嗜性和分类 39
四、人免疫缺陷病毒的基因表达调控 40
（一）HIV的启动子 40
（二）HIV基因组RNA及mRNA的合成 41
（三）HIV的调控蛋白Tat和Rev 42
（四）HIV的辅助蛋白 43
五、HIV-1感染与AIDS 44
第二节 人免疫缺陷病毒复制适应性及其在母婴传播中的作用 45
一、人免疫缺陷病毒母婴传播的流行及影响因素 45
（一）人免疫缺陷病毒母婴传播流行趋势 45
（二）人免疫缺陷病毒母婴传播途径 46
（三）人免疫缺陷病毒母婴传播的影响因素 48
二、人免疫缺陷病毒复制适应性在母婴传播中的作用 49
（一）人免疫缺陷病毒复制适应性的概念及系统建立 49
（二）人免疫缺陷病毒母婴传播病毒复制适应性靶细胞的选择及其应用 51
（三）高病毒复制适应性是人免疫缺陷病毒母婴传播的固有特征且由包膜蛋白gp120 V1～V5决定 52
三、人免疫缺陷病毒母婴传播存在选择性传播 54
（一）传播病毒包膜蛋白gp120 V1～V5多样性及其糖基化位点数目具有选择性 54
（二）传播病毒的复制适应性具有高选择性及选择性传播的可能机制 56
第三节 动物慢病毒及牛免疫缺陷病毒 57
一、动物慢病毒的进化 58
二、动物慢病毒的致病性 59
三、牛免疫缺陷病毒 60
（一）牛免疫缺陷病毒的发现、培养特征和基因组结构 60
（二）牛免疫缺陷病毒中国毒株BIV92044 61
（三）牛免疫缺陷病毒变种Jembrana disease virus 62
参考文献 63
第三章 慢病毒的转录调控——Jembrana病毒反式激活因子的调控机制 74
第一节 Jembrana病毒的分子生物学特征 75
一、JDV的基因组结构 75
二、JDV的长末端重复序列 76
三、JDV的结构蛋白 76
（一）Gag 76
（二）Pol 77
（三）Env 77
四、JDV的非结构蛋白 77
第二节 慢病毒Tat的反式激活作用 78
一、HIV Tat的结构和功能 78
二、Tat-TAR间的相互作用 80
三、P-TEFb对RNA聚合酶Ⅱ转录的影响 82
四、Tat与乙酰化酶的关系 84
五、BIV Tat的反式激活 85
第三节 JDV Tat功能域的精确划分 86
一、jTat生物信息学分析 86
（一）jTat的基本性质 86
（二）jTat磷酸化修饰预测 87
（三）jTat与bTat和hTat序列对比 87
（四）JDV和BIV LTR同源性的比较 87
（五）jTat反式激活能力的初步验证 88
二、jTat核心域的界定 88
（一）jTat核心功能域N端边界 89
（二）jTat核心功能域C端边界 90
（三）jTat激活域与结合域边界的划分 91
三、jTat C端具有较强的RNA结合能力 92
（一）hTat和bTat活性的验证 92
（二）三种Tat间嵌合蛋白的构建 93
（三）jTat结合域突变体的构建 94
（四）嵌合蛋白及突变体的功能验证 95
（五）JH没有活性与结合域完整性及细胞因子无关 96
四、jTat激活时采用与hTat激活类似的细胞因子 98
（一）jTat和hTat激活域对两种Tat活性具有抑制作用 98
（二）过量T1和CDK9不能增强jTat激活能力 99
（三）T1和CDK9反义转译质粒抑制jTat的激活能力 100
五、jTat N端激活域能与细胞因子直接结合 101
（一）jTat激活域具有独立的活性 101
（二）真核双杂系统相关质粒构建 102
（三）jTat激活域能与Cyclin T1相互作用 105
（四）完整的jTat激活域是其与Cyclin T1相互作用的关键 105
第四节 jTat激活域N端是其具有广泛活性的关键 107
一、JB能激活JDV和HIV LTR 107
二、jTat激活域能利用不同T1激活HIV LTR 108
三、jTat活性受N端，而非C端融合蛋白的影响 109
四、N端缺失1～15位氨基酸不影响jTat与T1的相互作用 110
五、jN21-hTat能激活三种LTR 111
（一）jTat N端与bTat和hTat融合蛋白的构建 111
（二）jN21-hTat能激活三种LTR 112
（三）jTat发挥多效性的可能作用模式 112
第五节 jTat能直接穿膜并影响胞内基因表达 113
一、Tat穿膜能力及其影响 114
（一）关于HIV Tat穿膜的研究 114
（二）与Tat类似的DNA/RNA结合多肽 114
（三）寡聚精氨酸多肽链的穿膜能力 115
（四）富含精氨酸多肽穿膜的可能机理 116
（五）Tat穿膜作用对宿主的影响 116
二、jTat具有直接穿膜的能力 117
（一）EGFP-jTat能直接穿越质膜进入细胞 117
（二）EGFP-jTat在细胞中的定位 119
（三）EGFP-jTat的穿膜是时间和剂量依赖性的 120
（四）EGFP-jTat穿膜是内吞和能量非依赖性的 121
（五）精氨酸是jTat穿膜的关键氨基酸 123
三、jTat影响胞内基因表达 125
（一）胞外的jTat能激活胞内的JDV LTR 125
（二）胞外jTat能激活胞内的NF-кB应答元件 125
第六节 小结 127
参考文献 129
第四章 慢病毒复制——牛免疫缺陷病毒的微管依赖性运输 137
第一节 病毒运输的重要轨道——微管 137
一、细胞骨架概述 138
二、微管的结构 138
三、微管组织中心 139
四、微管的极性 140
五、微管动力学 141
六、微管相关蛋白 142
七、微管马达蛋白 142
（一）马达蛋白概述 142
（二）微管与细胞内物质运输 143
（三）胞质动力蛋白的结构和功能 143
（四）驱动蛋白的组成和功能 145
（五）马达蛋白与病毒蛋白的相互作用 146
第二节 几种典型病毒的运输 147
一、HIV-1 147
（一）HIV-1在感染早期的运输中与细胞骨架的相互作用 147
（二）HIV-1在感染晚期的运输中与细胞骨架的相互作用 149
二、人泡沫病毒 150
三、牛痘病毒 150
四、腺病毒Ⅱ型 151
五、单纯疱疹病毒Ⅰ型 151
第三节 微管和马达蛋白在BIV反向运输中的作用 153
一、微管对BIV的感染具有重要作用 153
（一）BIV指示细胞系的构建原理 153
（二）BIV完成生活周期需要微管的参与 154
（三）BIV感染的早期事件需要微管的参与 155
二、BIV对微管动力学的调节 157
（一）BIV感染保护微管不被解聚 157
（二）BIV促进微管的稳定性 158
三、BIV反向运输依赖于微管 158
（一）BIV感染早期病毒颗粒的亚细胞定位 158
（二）BIV的反向运输需要微管参与 159
（三）微管是BIV反向运输的通道 161
四、BIV反向运输依赖于dynein 161
（一）BIV的感染需要dynein的功能 161
（二）BIV的反向运输是由dynein介导的 162
第四节 牛免疫缺陷病毒微管运输的分子机制 164
一、BIV CA与dynein轻链亚基LC8存在相互作用 164
（一）筛选病毒蛋白与dynein亚基的相互作用 164
（二）CA与LC8在体内、体外和病毒感染中都存在相互作用 165
（三）CA蛋白中LC8结合区域的界定 167
二、LC8是介导BIV反向运输的关键 168
（一）LC8对BIV的感染必不可少 168
（二）BIV的反向运输需要LC8 169
（三）LC8是连接病毒颗粒与微管和dynein的纽带 170
三、病毒早期运输受阻会推迟病毒复制 172
（一）微管药物可以使病毒复制推迟 172
（二）LC8基因沉默使病毒复制严重推迟 173
第五节 牛免疫缺陷病毒与其他病毒运输机制的比较 175
一、BIV感染早期事件揭秘 175
二、BIV反向运输的独特性 176
（一）BIV感染早期对微管依赖性更强 176
（二）BIV微管运输的效率不如HIV-1 176
（三）BIV对微管具有独特的调节作用 176
（四）不依赖于微管的病毒运输 177
三、病毒蛋白与马达蛋白的相互作用 177
（一）dynein是病毒反向运输的通用马达 177
（二）病毒货物的多样性 178
（三）结合LC8是偶然还是必然 178
四、“以毒攻毒”的策略 179
第六节 小结 180
参考文献 181
第五章 慢病毒与细胞凋亡——牛免疫缺陷病毒反式激活因子诱导细胞凋亡的分子机制 187
第一节 病毒与细胞凋亡 187
一、caspase家族和caspase信号通路 187
二、微管与细胞凋亡 189
三、病毒与细胞凋亡 189
（一）病毒与细胞凋亡 189
（二）HIV与细胞凋亡 195
第二节 BIV感染引起细胞凋亡 196
第三节 BTat和JTat蛋白引发细胞凋亡 199
一、BTat蛋白引发细胞凋亡 199
二、JTat蛋白诱导细胞凋亡 202
三、BTat、JTat激活Caspase信号通路 204
第四节 BTat、JTat影响微管的动力学 206
一、BTat、JTat与微管蛋白及微管的相互作用 206
二、BTat、JTat促进微管聚合 210
三、BTat、JTat增加微管的稳定性 212
第五节 Bim介导了JTat所引发的细胞凋亡 213
一、JTat引发的细胞凋亡与JTat干扰微管动力学具有相关性 213
二、JTat与其他微管相关蛋白及试剂在诱导凋亡上具有相似性 214
三、Bim介导了JTat引发的细胞凋亡 215
第六节 小结 216
一、病毒与细胞凋亡 217
二、BTat、JTat与细胞凋亡 218
三、BTat、JTat与微管 219
四、微管相关因子Bim介导了凋亡的发生 219
参考文献 220
第六章 慢病毒的潜伏机制——干扰素刺激基因产物bISG15与牛免疫缺陷病毒的潜伏感染 224
第一节 干扰素刺激基因表达蛋白bISG15 224
一、干扰素刺激基因表达蛋白 225
二、牛干扰素刺激基因15蛋白——bISG15 226
第二节 胎牛肺细胞（FBL）中bISG15的表达 228
一、LPS和poly I:C可以提高FBL中bISG15的表达 228
二、IRF-3参与poly I:C激活bISG15表达 230
第三节 FBL中BIV与bISG15的相互影响 234
一、BIV感染FBL可以刺激bISG15表达增加 234
二、bISG15过表达可以抑制FBL中BIV的复制 235
三、BIV的Tat可以抑制IRF-3对bISG15表达的激活 237
四、bISG15在BIV潜伏感染中的可能作用 238
第四节 BHV-1、BVDV感染FBL对bISG15表达的影响 240
一、BVDV、BHV-1感染FBL抑制bISG15的表达 240
二、BHV-1的早早期蛋白bICP0抑制IRF-3对bISG15表达的激活 241
三、bISG15在BIV/BHV-1、BIV/BVDV超感染中的可能作用 242
第五节 小结 243
参考文献 244
第七章 疱疹病毒超感染调节细胞信号通路激活慢病毒的复制 246
第一节 HIV重要超感染病毒——疱疹病毒（herpesviruse） 247
一、疱疹病毒 247
二、单纯疱疹病毒 249
（一）HSV的基因表达调控 249
（二）HSV-1早早期调控蛋白ICP0 250
（三）环指蛋白 252
第二节 BHV-1早早期蛋白bICP0可激活BIV LTR的表达 253
一、BHV-1超感染可以激活BIV基因表达 253
二、BHV-1早早期蛋白bICP0可通过NF-кB细胞信号通路激活BIV LTR的表达 255
第三节 bICP0和其环指结构域具有泛素连接酶E3活性 257
一、泛素与泛素化修饰 257
（一）催化泛素反应的酶 257
（二）泛素化修饰在NF-кB细胞信号通路中的调节作用 259
二、bICP0和其环指结构域具有泛素连接酶E3活性 260
（一）bICP0能在体外催化多聚泛肽链的形成 261
（二）bICP0功能域分析 263
（三）bICP0在不同的E2存在下催化形成不同的多聚泛肽链型 264
（四）bICP0能催化自身的泛素化反应 265
第四节 ICP0/bICP0对NF-кB信号通路的调节 267
一、NF-кB信号通路 267
（一）NF-кB因子及其抑制蛋白IкB 267
（二）NF-кB通路的激活 269
二、病毒及其蛋白质对NF-кB通路的激活 270
三、ICP0/bICP0对NF-кB信号通路的调节 272
（一）bICP0激活BIV LTR需要其上潜在的NF-кB位点 273
（二）ICP0/bICP0对NF-кB的激活需要其结构的完整 275
（三）ICP0/bICP0能导致NF-кB因子的活化 277
（四）ICP0/bICP0对NF-кB的激活与磷酸化无关 280
（五）ICP0/bICP0对NF-кB的激活与泛素-蛋白酶体途径相关 282
（六）ICP0/bICP0能通过泛素化IкBα方式激活NF-кB 284
四、初步结论和尚未回答的科学问题 288
（一）ICP0能通过直接泛素化IкBα而激活NF-кB信号通路 288
（二）ICP0激活NF-кB通路的可能后果 289
（三）尚未回答的问题 291
第五节 ICP0/bICP0对AP-1信号通路的调节 291
一、转录因子AP-1及AP-1通路的激活 291
二、病毒及其蛋白质对AP-1通路的激活 294
三、ICP0/bICP0对AP-1信号通路的调节 294
（一）bICP0激活BIV LTR需要其上潜在的AP-1位点 294
（二）ICP0对AP-1的激活可借助c-Jun磷酸化 297
（三）ICP0对AP-1的激活与JNK相关 298
（四）ICP0能提高JNK激酶的活性 302
（五）ICP0对AP-1的激活需要完整的环指结构且与通路上游TAK1而非TRAF6相关 304
（六）ICP0能与TAK1激酶相互作用并激活TAK1激酶，且这种激活需要ICP0环指结构域的完整性 306
四、ICP0激活AP-1通路的可能后果 307
第六节 小结 309
参考文献 312
第八章 慢病毒整合酶的结构——牛免疫缺陷病毒整合酶的结构生物学 325
第一节 人免疫缺陷病毒的结构生物学研究 325
一、包膜蛋白 325
二、结构蛋白 326
三、酶类 328
（一）反转录酶 328
（二）蛋白酶 328
（三）整合酶 329
四、调节蛋白 329
（一）Tat 329
（二）Rev 331
（三）Nef 331
（四）其他 331
第二节 探索整合酶靶点的结构 331
一、整合酶结构域的结构 332
（一）N端结构域 332
（二）催化核心结构域 332
（三）C端结构域 333
二、整合酶全长及包含两个结构域片段的结构生物学 333
三、整合酶与药物结合机制的结构研究 335
四、整合酶与宿主因子LEDGF的结构研究 336
五、有待解决的问题 337
第三节 BIV整合酶的结构生物学研究 337
一、BIV整合酶结构域的预测 338
二、BIV整合酶核心结构域的结构生物学研究 338
（一）BIV整合酶核心结构域的可溶性表达、纯化及分子筛层析 338
（二）BIV整合酶核心结构域晶体的生长和衍射 340
（三）BIV整合酶核心结构域结构的解析 341
（四）BIV整合酶核心结构域的晶体结构 342
（五）两种晶体结构的比较 343
（六）从新的BCCD二聚体晶体结构探究整合酶-宿主DNA相互作用机理 344
第四节 小结 346
参考文献 347
第九章 基于牛免疫缺陷病毒的抗AIDS药物筛选体系的建立 352
第一节 抗AIDS药物研究进展 352
一、抗AIDS药物的发展历程 352
二、抗AIDS药物的主要靶点 355
（一）进入靶点 355
（二）反转录酶靶点 355
（三）整合酶靶点 356
（四）蛋白酶靶点 357
（五）成熟靶点 358
三、耐药 359
（一）耐药现象 359
（二）耐药机理 359
（三）耐药的分析方法 360
四、抗AIDS药物的筛选 360
（一）分子水平的筛选方法 360
（二）细胞水平的筛选方法 361
第二节 应用牛免疫缺陷病毒进行抗AIDS药物筛选 364
一、应用BIV筛选抗AIDS药物的可行性分析 364
（一）与HIV抗病毒靶位比较 364
（二）建立基于BIV的抗艾滋病药物高通量筛选模型的可行性 365
（三）小动物模型——BIV-兔模型 366
二、建立BIV指示细胞系 366
（一）BHK-21是BIV的许可细胞系 366
（二）以绿色荧光蛋白为报告基因的BIV指示细胞系的建立 368
（三）以萤火虫萤光素酶为报告基因的BIV指示细胞系的建立 371
三、基于BIV指示细胞系筛选模型的建立 374
（一）建立稳定的病毒储液 374
（二）基于BIV指示细胞系的筛选方法 375
（三）BIV高通量筛选体系的评估 375
（四）BIV筛选模型的药物靶位分析 376
四、BIV应用于抗AIDS药物高通量筛选的优势 378
（一）定量检测方法——指示细胞系 378
（二）稳定的病毒储液 379
（三）高通量的检测和分析手段 379
第三节 复筛体系的建立 379
一、正对照药物的检测 380
二、HIV-1假病毒检测体系符合高通量筛选要求 380
第四节 小结 381
参考文献 382
第十章 BHIV cDNA的构建及其生物学活性 389
第一节 BHIV嵌合病毒 389
一、嵌合病毒的生物学意义及应用 389
二、BIV与HIV基因组结构和功能的比较 391
（一）BIV与HIV在进化上的亲缘关系 391
（二）BIV与HIV的基因组结构比较 392
（三）BIV与HIV结构基因的同源性比较 393
（四）BIV与HIV基因功能的相关性 393
（五）BIV与HIV在感染和致病方面的差异 394
三、BHIV在AIDS疫苗研发中的意义 394
第二节 互换结构基因的BHIV嵌合病毒 395
一、BIV127 cDNA在人源细胞MT-4中的活性检测 395
（一）BIV127 cDNA转染MT-4细胞后可以表达出多种病毒蛋白 395
（二）BIV127 cDNA转染MT-4细胞后不能形成有感染性的病毒颗粒 396
二、互换结构基因的BHIV cDNA的构建及活性 396
（一）以HIV为主体的Bgag HIV和以BIV为主体的BHenv IV cDNA的设计 396
（二）Bgag HIV和BHenv IV的生物学活性 398
三、结果分析 399
第三节 用BIV非结构基因取代HIV非结构基因的BHIV嵌合病毒 401
一、替换非结构基因的BHIV cDNA的构建 401
二、嵌合克隆Bvif HIV、Btat HIV和BLRTtat HIV在人源细胞中的生物学活性 402
（一）Bvif HIV、Btat HIV和BLRtat HIV在人源细胞中的转录 402
（二）蛋白质水平检测嵌合病毒Bvif HIV、Btat HIV和BLRTtat HIV cDNA在人源细胞中的表达 402
（三）Btat HIV可以产生有感染性的病毒 404
（四）显微镜下观察感染传代细胞的形态学改变 405
（五）电镜检测病毒颗粒的形成 406
三、结果分析 406
（一）3种嵌合克隆转染人源细胞均有表达活性 406
（二）嵌合克隆Bvif HIV cDNA在H9细胞中不能产生感染性病毒的原因 406
（三）BIV Tat可以取代HIV-1 Tat，产生具有生物学活性的嵌合病毒Btat HIV 407
（四）在MT-4细胞中，BIV Tat与BIV LTR的相互作用不能产生感染性病毒 409
第四节 引入CMV启动子的BHIV嵌合病毒 410
一、引入CMV启动子的BHIV cDNA的构建 410
二、pc3G1、pc3G2、pc3G3和pc3G5嵌合病毒cDNA在人源细胞中的生物学活性 411
（一）4个嵌合病毒cDNA的早期基因和晚期基因都能转录及正确剪切 411
（二）4个嵌合病毒的晚期基因都能正常翻译 412
三、病毒颗粒的检测 412
（一）4种嵌合病毒都能在293T细胞中包装出病毒颗粒 412
（二）病毒颗粒的核心蛋白没有完全剪切，病毒颗粒处于前成熟状态 413
（三）病毒颗粒都包含反转录酶活性，但是pc3G1的反转录酶活性明显低于其他3个 414
（四）嵌合病毒都含有基因组RNA 415
四、病毒颗粒感染MT-4细胞实验 416
（一）嵌合病毒颗粒能够吸附并进入MT-4细胞 416
（二）pc3G3能在MT-4细胞中完成反转录过程 416
（三）未能在MT-4细胞中检测到整合的病毒基因组DNA，也未能检测到病毒的子代RNA 416
五、长期传代实验和免疫小鼠实验 417
（一）实验组小鼠中都能检测到病毒特异性的抗体，但是滴度不高 417
（二）实验组和正对照组均未检测到显著的病毒特异性CTL反应 417
六、结果分析 418
（一）嵌合病毒基因产物的表达和装配情况 418
（二）BIV p3在嵌合病毒装配中发挥了重要的作用 419
（三）HIV-1蛋白酶对BIV底物剪切的低效率是导致嵌合病毒颗粒处于前成熟状态的直接原因 419
（四）HIV-1蛋白酶对BIV底物剪切的特异性与保守性分析 419
（五）HIV-1蛋白酶对嵌合Gag蛋白位点的切割顺序和效率 421
（六）BIV NC对HIV-1包装信号的识别及嵌合病毒基因组RNA的装配 421
（七）BHIV嵌合病毒未能持续传代的可能原因分析 422
第五节 小结 423
参考文献 424
第十一章 携带中国CRF07_BC HIV-1毒株env基因的SHIV嵌合病毒 428
第一节 AIDS疫苗研究概况 428
一、艾滋病疫苗研发资源 428
二、我国的艾滋病疫苗研究 429
第二节 AIDS疫苗评价的动物模型 430
一、SIV研究概况及其与HIV的比较 431
（一）SIV的研究概况 431
（二）SIV和HIV的相同点 432
（三）SIV和HIV的不同点 433
二、AIDS疫苗评价的动物模型 433
（一）HIV疫苗研制需要合适的动物模型 433
（二）SHIV的构建及特征 433
（三）SHIV在AIDS疫苗研究中的应用 434
三、SHIV的研究进展 436
第三节 中国株SHIV感染性克隆的构建 436
一、重组SHIV克隆的构建策略及基因组结构 437
（一）B亚型致病性SHIV-KB9分子克隆 439
（二）三株中国SHIV感染性克隆的基因组结构 439
二、外源基因的获得 441
三、全长SHIV克隆的构建、筛选和鉴定 442
（一）携带中国HIV-1 env基因的半长SHIV克隆的筛选 442
（二）携带不同HIV-1基因的SHIV全长克隆的构建和筛选 442
（三）具有感染能力的SHIV克隆株的筛选 444
（四）三株SHIV克隆的背景资料和亚型分类 445
第四节 中国株SHIV感染性克隆细胞水平活性分析 446
一、SHIV病毒颗粒的电镜观察 446
二、SHIV的细胞嗜性检测 448
三、SHIV在恒河猴PBMC中的细胞病变观察 450
四、SHIV在人淋巴细胞中感染活性的比较 451
五、DNA PCR检测SHIV在人PBMC细胞中的整合 451
六、多株SHIV在恒河猴CD4+T淋巴细胞中感染活性的比较 452
第五节 中国株SHIV感染性克隆在中国源恒河猴体内的感染活性 454
一、SHIV-XJ02170的恒河猴感染和传代实验 454
（一）在中国恒河猴体内的传代过程 454
（二）SHIV-XJ02170传代后外周血CD3、CD4、CD8流式分析 454
（三）SHIV-XJ02170病毒载量检测 455
（四）SHIV-XJ02170病毒传代后全血cDNA PCR分析 456
（五）SHIV-XJ02170传代后血浆结合抗体阳转时间分析 456
二、SHIV-CN97001的恒河猴感染和传代实验 457
（一）SHIV-CN97001在中国恒河猴体内传代过程及传代病毒RNA载量分析 457
（二）SHIV-CN97001感染后病毒cDNA PCR鉴定 458
三、SHIV-XJDC6431的恒河猴感染和传代实验 459
（一）血浆病毒RNA载量检测 459
（二）CD4细胞计数和CD4/CD8值分析 460
（三）SHIV-XJDC6431感染后病毒的cDNA PCR鉴定 461
（四）血清中HIV-1特异性结合抗体检测 462
（五）SHV-XJDC6431在猴体内的传代实验 462
第六节 小结 463
一、无奈选择——人造病毒SHIV 464
（一）具有代表性的SHIV的总结 464
（二）SHIV嵌合病毒在恒河猴模型中的应用 467
二、获得感染性SHIV嵌合病毒成功的关键 470
（一）SHIV骨架及HIV-1外源片段的选择 471
（二）恒河猴种属差异及病毒-宿主关系 471
（三）病毒在体内的适应过程——通过猴体传代得到致病株 472
三、展望 472
参考文献 473
下篇 泡沫病毒分子生物学 479
第十二章 泡沫病毒概述 479
第一节 泡沫病毒的复制 479
一、病毒颗粒的超微结构 480
二、泡沫病毒基因组 481
三、泡沫病毒的复制特点 482
（一）反转录 482
（二）整合 483
四、与正反转录病毒、嗜肝DNA病毒复制策略的比较 484
第二节 泡沫病毒的基因表达调控 485
一、泡沫病毒的启动子 485
（一）泡沫病毒5'LTR启动子 485
（二）泡沫病毒的内部启动子 486
二、亚基因组转录物 487
（一）来源于内部启动子的剪接转录物 487
（二）源于5'LTR的gag、pol和env的剪切转录物 487
（三）源于5'LTR的bel剪接转录物 488
三、FV基因表达的转录后调控 488
四、泡沫病毒的结构蛋白 489
（一）Gag蛋白 489
（二）Pol蛋白 489
（三）Env蛋白 490
五、泡沫病毒的调控蛋白 491
六、FV其他基因产物在FV基因表达调控中的作用 493
七、泡沫病毒介导的细胞基因表达的变化 494
八、LTR和IP指导的基因表达的调控 494
第三节 泡沫病毒Gag和Pol蛋白的翻译后加工 495
一、病毒和细胞内天冬氨酸蛋白酶 496
二、泡沫病毒的蛋白酶 496
三、Gag和Pol蛋白的水解加工过程 497
（一）Gag水解加工 497
（二）Pol的加工剪切 498
四、FV PR的调控 498
第四节 病毒颗粒的装配和基因组包装 498
一、病毒颗粒的装配 498
二、Pol合成和组装 500
（一）泡沫病毒的Pol合成 500
（二）泡沫病毒的Pol包装 500
三、RNA基因组包装 500
（一）泡沫病毒的顺式作用序列 500
（二）泡沫病毒的反式作用元件 501
第五节 泡沫病毒包膜糖蛋白 501
一、泡沫病毒包膜糖蛋白的特点 501
二、包膜糖蛋白介导的膜融合 502
三、包膜糖蛋白与泡沫病毒颗粒的释放 502
第六节 泡沫病毒载体 504
一、泡沫病毒载体的优势 504
二、泡沫病毒载体系统 506
（一）可复制的泡沫病毒载体 506
（二）复制缺陷型载体 507
（三）产生高滴度的病毒储液 507
三、顺式作用元件 508
四、包装细胞系 509
第七节 灵长类泡沫病毒 509
一、非人类灵长类泡沫病毒的系统进化 509
二、灵长类泡沫病毒在细胞培养中的宿主范围 511
三、灵长类泡沫病毒感染与免疫 511
四、灵长类泡沫病毒感染的低等动物模型 511
五、泡沫病毒对人的感染 512
第八节 非灵长类动物泡沫病毒 513
一、几种重要的非灵长类动物泡沫病毒 513
（一）牛泡沫病毒 513
（二）猫泡沫病毒 513
（三）马泡沫病毒 513
二、非灵长类动物泡沫病毒的分子生物学特征 514
（一）gag基因 514
（二）pol基因 514
（三）env基因 515
（四）辅助基因（调节基因） 515
参考文献 516
第十三章 牛泡沫病毒中国毒株BFV3026的分子生物学 526
第一节 牛泡沫病毒中国株的分子生物学鉴定 526
一、反转录酶活性检测 527
二、Southern blot确证3026属于BFV 527
三、3026病毒株基因片段的克隆及鉴定 528
（一）PCR扩增及杂交 528
（二）序列分析 528
第二节 BFV3026的宿主范围及培养特性 529
一、BFV3026的宿主范围 529
二、BFV3026可使细胞发生强烈病变 529
三、BFV3026可在部分细胞中建立持续性感染 530
四、BFV3026的培养特性 531
五、BFV与宿主相互关系浅析 531
（一）兔子对BFV3026的感染产生持续性高水平免疫应答 531
（二）BFV3026在兔子白细胞中运行的正常生活周期 532
（三）BFV3026可侵染兔子的多种脏器 533
第三节 BFV3026感染性克隆 534
一、pBS-BFV的感染性测定 534
（一）pBS-BFV可诱使细胞发生病变 534
（二）pBS-BFV能行使正常转录功能 535
（三）pBS-BFV可表达病毒所需蛋白质 536
（四）pBS-BFV转染细胞可产生病毒颗粒 536
二、BFV3026基因组序列分析 537
（一）序列测定与比较 537
（二）蛋白质二级结构比对 540
第四节 BFV3026包装和出芽的相关研究 541
一、包装细胞系的建立 542
（一）pBS-FV对BL12细胞感染性测定 542
（二）Gag-Pol及Env表达质粒的构建 542
（三）包装细胞克隆的分离 542
（四）包装功能测定 543
二、转移顺式调控元件 544
（一）BFV介导的基因转移依赖两个顺式元件的存在 544
（二）CASⅠ、CASⅡ对于BFV3026介导的基因转移同等重要 546
（三）BFV3026 CASⅠ对BFV蛋白表达的影响 547
三、BFV3026衣壳的组装和出芽的机制 550
（一）质粒构建和功能分析 550
（二）BFV3026的组装和出芽 552
第五节 BFV基因组RNA的二聚化 554
一、体外二聚化条件的确立 554
（一）二聚化的形成依赖一定的盐浓度 554
（二）温度对二聚化形成的影响 555
（三）BFV3026 1567nt RNA二聚体的热稳定性 555
（四）二聚化的动力学研究 556
二、BFV3026基因组RNA二聚化位点的界定 557
（一）初步界定 557
（二）精细定位 558
第六节 BFV3026的反式激活因子对两类启动子的激活 559
一、BTas蛋白是BFV的反式激活因子 559
（一）BFV3026编码自身的反式激活因子 559
（二）BFV3026编码249个氨基酸的BTas蛋白即为自身的反式激活因子 559
二、BTas蛋白在BFV LTR上的应答元件（TRE） 560
（一）位于U3的-983/-668（TREⅠ）和-470/-140（TREⅡ）两区段是BTas蛋白的正调控元件 560
（二）TREⅡ类似增强子元件 561
（三）BFV LTR TREⅡ的进一步界定 562
三、BFV LTR RU5区的负调控作用 566
四、BFV env基因3′端编码一个内部启动子 567
（一）BFV内部启动子的克隆 567
（二）克隆片段的序列分析 567
（三）克隆片段的功能分析 568
（四）不同病毒内部启动子同源性比较 568
（五）完整的BFV IP位于BFV基因组9117～9405之间 570
（六）BTas蛋白的应答元件（TREIP）位于9205～9276的72bp区段 572
（七）TREIP具有典型的增强子特点 573
（八）Tas对IP的激活作用必须有TATA盒的参与 574
（九）BFV ORF-1蛋白是IP起始基因表达唯一所需的病毒辅助蛋白 575
（十）BFV Tas蛋白与TREIP的相互作用 576
五、BTas蛋白对BFV LTR和IP激活作用的比较 577
（一）BFV LTR和IP基础活性的比较 577
（二）BTas蛋白对BFV LTR和IP激活活性的比较 578
六、BFV和BIV共感染过程中的相互作用 579
（一）BFV3026对BIV LTR整体水平上的激活作用 579
（二）BFV的反式激活因子BTas对BIV LTR的激活作用 580
（三）BTas与Tat协同激活BIV LTR起始基因表达 580
（四）BIV对BFV LTR的激活作用 581
第七节 指示细胞系的建立 582
一、BICL细胞系的构建 582
（一）细胞转染及G418初筛 582
（二）单克隆化 582
（三）指示细胞系的初步鉴定 583
（四）指示细胞系与CPE方法的比较 583
（五）两种感染方法滴度比较 584
（六）指示细胞系对于不产生CPE的病毒感染的检测 585
（七）指示细胞系用于检测BFV的体外宿主细胞范围 587
（八）利用指示细胞系检测BFV的复制策略 588
二、BFVL细胞系的构建 589
（一）BFVL指示细胞系的构建 589
（二）BFVL指示细胞系响应BFV感染的特异性 590
（三）BFVL指示细胞系响应BFV感染的敏感性 591
（四）BFVL指示细胞系对不同感染滴度的BFV的响应 591
（五）BFVL指示细胞系的萤光素酶活性表达与BFV滴度的相关性 592
第八节 BFV3026的反式激活因子BTas的功能 593
一、BTas的亚细胞定位 593
二、BTas转录物的研究 594
（一）BTas转录物的确定 594
（二）BFV感染细胞btas特异性转录物的动力学变化 596
（三）btas 4种转录物功能检测 597
三、BTas的结构域的确定 601
（一）DNA结合结构域 601
（二）激活结构域的界定 602
四、BTas的二聚化 604
（一）BTas能够在体内和体外形成多聚复合物 604
（二）BTas能够在哺乳动物细胞核内形成二聚体 605
（三）确定BTas的二聚化位点 606
（四）BTas的核定位并不需要BTas的二聚化 607
（五）BTas与BFV LTR和IP的结合不需要BTas的二聚化 608
（六）BTas的转录激活活性依赖于BTas的二聚化 610
第九节 小结 611
参考文献 611
第十四章 牛泡沫病毒通过活化细胞NF-кB信号通路促进其转录及复制 613
第一节 病毒与NF-кB信号通路 613
一、病毒激活NF-кB信号通路的机制 614
（一）HIV-1激活NF-кB信号通路 614
（二）HTLV-1激活NF-кB信号通路 615
（三）疱疹病毒激活NF-кB信号通路 615
（四）嗜肝病毒激活NF-кB信号通路 615
二、NF-кB信号通路对于病毒复制的多效性 616
三、病毒通过NF-кB信号通路控制凋亡 617
四、病毒通过NF-кB信号通路促进细胞转化 617
第二节 BFV激活细胞内NF-кB信号通路 617
一、BFV感染激活细胞内NF-кB信号通路 617
二、BTas激活细胞NF-кB信号通路 620
三、BTas激活细胞NF-кB信号通路的特异性 621
四、BTas激活细胞NF-кB信号通路的分子机制 621
（一）BTas激活细胞NF-кB信号通路需要其结构的完整性 621
（二）BFV及BTas通过引起IкBα磷酸化激活NF-кB信号通路 621
（三）BTas引起的IкBα磷酸化及NF-кB激活需要活化IKKβ 623
（四）BTas能够引起p100的剪切 624
（五）BTas与IKKα和IKKβ相互作用 625
第三节 NF-кB的活化增强BFV的转录 627
一、NF-кB的活化增强BTas介导的LTR的转录 627
二、BFV LTR是不含кB位点的启动子 628
第四节 BFV通过NF-кB增强其转录的机制 629
一、BTas与RelB相互作用 629
（一）BTas与RelB相互作用的确证 629
（二）BTas与RelB相互作用区域的确定 632
二、RelB促进BFV的转录及复制 634
（一）RelB增强BTas介导的BFV LTR的转录 634
（二）RelB增强BTas介导的LTR转录的特异性 634
（三）细胞内源RelB蛋白参与BTas介导的LTR转录 636
（四）RelB促进BFV的复制 638
三、RelB增强BTas介导的LTR转录的分子机制 638
（一）RelB增强BTas介导的LTR转录依赖于其与BTas的相互作用 638
（二）RelB的核定位对于其增强BTas介导的LTR转录也是必需的 639
（三）RelB的TAD对于其增强BTas介导的LTR转录也是必要的 640
（四）RelB增强BTas介导的LTR转录需要LTR上的元件 641
（五）BFV复制过程中RelB蛋白存在于病毒LTR的转录复合物之中 643
四、BFV感染通过其反式激活因子BTas增强细胞内RelB的转录 644
第五节 小结 646
参考文献 648
第十五章 宿主因子对泡沫病毒的转录调控 651
第一节 Enolase对BFV转录的调控作用 652
一、Enolase蛋白其他功能 653
二、α-Enolase对PFV启动子的转录调控机制 653
（一）Enolase结合区域界定 654
（二）Bell结合区域界定 654
（三）Enolase对PFV转录启动子的抑制作用 655
第二节 AP-1激活BFV IP转录调控 657
一、AP-1的生物学特性及功能 658
（一）AP-1的组成和生化特性 658
（二）AP-1转录因子参与不同的生化途径 658
（三）TPA:AP-1的激活因子 659
二、AP-1激活BFV IP 660
（一）TPA激活BFV IP 660
（二）AP-1激活BFV IP 661
（三）c-Jun突变体抑制TPA对BFV IP的激活 662
（四）AP-1激活BFV IP系列缺失体研究 662
（五）BFV IP中AP-1应答元件点突变研究 663
（六）AP-1应答元件的EMSA实验 664
（七）TPA和AP-1促进病毒蛋白BTas表达 668
（八）TPA和AP-1能够提高病毒的复制水平 668
第三节 小结 669
一、宿主对泡沫病毒的防御 670
二、AP-1与泡沫病毒的时序调控模型 670
参考文献 673
第十六章 干扰素诱导蛋白IFP35通过与泡沫病毒调控蛋白相互作用抑制病毒的复制 678
第一节 泡沫病毒与干扰素研究进展 678
一、干扰素的性质和作用 678
二、病毒感染与IFN系统 679
（一）IFN-α/β产生的诱导机制 679
（二）IFN-α/β经典信号传导途径 680
（三）干扰素诱导的抗病毒活性 681
（四）病毒拮抗干扰素的作用 683
三、干扰素抗泡沫病毒的研究进展 685
四、干扰素诱导蛋白PML抗泡沫病毒的研究进展 686
第二节 Tetherin抗原型泡沫病毒的机制 686
一、Tetherin的研究现状 688
（一）Tetherin简介 688
（二）Tetherin的抗病毒作用 688
二、Tetherin抑制PFV释放的机制 692
（一）Tetherin抑制PFV的释放 692
（二）Tetherin的跨膜区和GPI锚定区对抑制PFV的释放至关重要 693
（三）Tetherin的二聚化和糖基化作用对其抑制PFV释放的功能的影响 693
（四）不同种属的Tetherin对PFV的抑制作用 695
第三节 IFP35抗泡沫病毒的机制探讨 696
一、IFP35简介 697
二、IFP35抗泡沫病毒的机制 697
（一）确证BTas与IFP35的相互作用 697
（二）在293T细胞中过表达IFP35能够抑制BFV的感染 700
（三）在HeLa细胞中过表达IFP35不能够抑制BFV的感染 701
（四）BTas和IFP35的定位 702
（五）IFP35抑制BTas介导的BFV LTR的反式激活作用 703
（六）IFP35不能抑制BTas介导的BFV IP的反式激活作用 705
（七）IFP35的抑制作用不依赖于AP-1和NF-кB信号通路 705
（八）通过RNAi敲除内源性IFP35的表达能增加BTas介导的BFV LTR的激活作用 706
（九）IFP35不能抑制BTas结合于BFV LTR 709
（十）IFP35对PFV的作用 710
第四节 Nmi抗牛泡沫病毒的机制 713
一、Nmi与IFP35 713
二、Nmi抗BFV的机制 714
（一）过表达Nmi能够抑制BFV的感染 714
（二）通过RNAi降低内源性Nmi的表达能增强BFV的复制 715
（三）Nmi抑制BTas介导的BFV LTR和IP的反式激活作用 717
（四）确证BTas与Nmi的相互作用 719
（五）BTas与Nmi的相互作用是Nmi行使抑制功能所必需的 721
（六）BTas和Nmi的定位 723
第五节 小结 724
参考文献 725
第十七章 microRNA调控泡沫病毒的转录与复制 734
第一节 microRNA的生物学特征 734
一、microRNA的产生 734
二、microRNA的生物合成 735
（一）microRNA的转录调控 735
（二）microRNA的成熟与加工 735
三、microRNA对靶位点的识别规律 736
第二节 microRNA与病毒感染 737
一、宿主microRNA影响病毒的复制 737
二、病毒microRNA影响病毒自身的复制 738
三、病毒microRNA对宿主细胞的影响 739
四、病毒通过调节宿主microRNA影响宿主基因的功能 739
五、RNA病毒是否可以产生miRNA 740
第三节 寻找靶向泡沫病毒PFV tas基因的宿主microRNA 740
一、病毒PFV受宿主细胞microRNA的调控 741
二、计算机软件的分析预测 742
三、报告基因与表达质粒构建 742
第四节 has-miR-491-5p的表达谱检测 744
一、poly(A)qRT-PCR检测microRNA表达的原理 744
二、用poly(A)qRT-PCR检测has-miR-491-5p的表达 745
（一）检测has-miR-491-5p瞬式表达 745
（二）检测has-miR-491-5p在细胞系及人组织中的表达 746
三、miRNAmap数据库分析结果 746
第五节 has-miR-491-5p对靶位点的识别与抑制作用 747
一、has-miR-491-5p可显著抑制pEGFP-C1-T491的表达 747
二、has-miR-491-5p对pEGFP-C1-T491表达抑制的特异性 749
（一）瞬时转染p19对has-miR-491-5p介导基因表达抑制的解救 749
（二）p19稳定表达细胞系可阻止has-miR-491-5p介导基因表达抑制 749
（三）特异性单链核酸抑制剂可解救has-miR-491-5p介导的基因表达抑制 749
三、has-miR-491-5p在mRNA水平抑制靶基因的表达 750
第六节 has-miR-491-5p对PFV复制及基因表达的影响 752
一、has-miR-491-5p有效抑制PFV Tas介导的转录激活 752
二、has-miR-491-5p可显著抑制病毒的滴度 753
三、has-miR-491-5p抑制PFV的复制及病毒蛋白的合成 754
（一）has-miR-491-5p可显著抑制PFV基因组的复制 754
（二）has-miR-491-5p可显著抑制PFV tas基因的表达 756
（三）has-miR-491-5p可显著抑制PFV Gag基因的表达 756
四、初步结论和尚未回答的科学问题 756
第七节 小结 756
参考文献 758
第十八章 牛泡沫病毒反式激活因子乙酰化调控的分子机制 762
第一节 蛋白质的乙酰化修饰 762
一、染色质与转录激活 762
二、乙酰化蛋白质的多样性及功能 764
三、HAT家族 765
（一）GNAT超家族 766
（二）p300/CBP家族 767
（三）MYST家族 768
第二节 病毒复制与乙酰化调控 769
一、HIV-1反式激活因子Tat的乙酰化调控机制 770
（一）Tat功能与乙酰化相关的发现 771
（二）Tat的乙酰化及其作用机制 771
（三）Tat与组蛋白乙酰化 773
（四）Tat通过乙酰化影响与宿主相互作用 773
（五）HIV-1与乙酰化的其他研究 774
二、HTLV-1反式激活因子Tax的乙酰化调控机制 774
（一）HAT与Tax的相互作用 775
（二）Tax抑制p53功能 776
（三）HAT参与HTLV-1染色质重构 776
（四）Tax的乙酰化修饰 777
三、PFV反式激活因子Tas的乙酰化调控机制 777
第三节 牛泡沫病毒反式激活因子BTas的乙酰化调控机制 777
一、乙酰化途径参与BFV启动子的反式激活 777
二、p300在体内和体外乙酰化BTas 779
三、鉴定p300乙酰化BTas的底物赖氨酸 780
四、p300调控BTas介导的反式激活水平 781
五、乙酰化赖氨酸与BTas的细胞定位无关 781
六、BTas的乙酰化增强其DNA结合能力 782
七、乙酰化赖氨酸对BTas的DNA结合能力是重要的 784
第四节 小结 784
参考文献 785
索引 790
后记 795