第1章 绪论 1
1.1基因工程的基本概念 1
1.2基因工程的研究内容 2
1.3基因工程诞生的基础 2
1.3.1基因工程诞生的理论基础 2
1.3.2技术上的三大突破 3
1.4基因工程技术的诞生 3
1.5基因工程的应用 5
1.5.1原核细胞基因工程 5
1.5.2植物基因工程 7
1.5.3动物基因工程 8
1.5.4基因治疗 8
1.5.5理论研究 9
1.6基因工程的安全性 9
1.7我国的《基因工程安全管理办法》 11
思考题 12
参考文献 13
第2章 基因工程的基本技术 14
2.1凝胶电泳技术 14
2.1.1基本原理 15
2.1.2琼脂糖凝胶电泳 15
2.1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳 17
2.1.4脉冲场凝胶电泳 18
2.1.5双向电泳技术 20
2.1.6凝胶电泳片段的回收与纯化 21
2.2分子杂交技术 22
2.2.1分子杂交的原理 22
2.2.2分子杂交的类型 24
2.3 PCR技术 26
2.3.1 PCR基本原理和反应过程 26
2.3.2 PCR反应的体系及其设计和优化 28
2.3.3 PCR产物的克隆 31
2.3.4 PCR技术的发展及其应用 36
2.4 DNA序列分析 47
2.4.1 Maxam-Gibert化学降解法 47
2.4.2 Sanger双脱氧链终止法 49
2.4.3 DNA序列分析的自动化 50
2.4.4 DNA序列的生物信息学分析 52
2.5基因芯片及数据分析 53
2.5.1基因芯片概念 54
2.5.2技术原理 54
2.5.3基因芯片的制备 54
2.5.4基因芯片的应用 55
2.6研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法 57
2.6.1酵母单杂交系统（可延伸双杂交） 57
2.6.2凝胶阻滞试验（Gel-shift） 57
2.6.3 DNaseⅠ足迹法 58
2.6.4噬菌体展示技术 58
思考题 59
参考文献 59
第3章 基因工程的工具酶 61
3.1限制性内切核酸酶 62
3.1.1限制性内切核酸酶的发现与种类 62
3.1.2限制性内切核酸酶的命名 63
3.1.3Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性 63
3.1.4影响限制性内切核酸酶活性的因素 66
3.1.5限制性内切核酸酶酶切DNA的方法 68
3.2 DNA连接酶 68
3.2.1 DNA连接酶的发现 68
3.2.2 DNA连接酶的种类 69
3.2.3黏性末端DNA片段的连接 69
3.2.4平末端DNA片段的连接 71
3.2.5影响连接反应的因素 73
3.3 DNA聚合酶和反转录酶 74
3.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其应用 75
3.3.2 E.coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段酶及其应用 76
3.3.3T4噬菌体DNA聚合酶 77
3.3.4 T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶 77
3.3.5反转录酶 78
3.4修饰酶类 79
3.4.1末端脱氧核苷酸转移酶 79
3.4.2T4多核苷酸激酶 79
3.4.3碱性磷酸酶 79
3.5其他工具酶 80
3.5.1 S1核酸酶 80
3.5.2 Bal 31核酸酶 81
3.5.3核酸外切酶 82
3.5.4 RNA酶 83
思考题 84
参考文献 84
第4章 基因工程的克隆载体 85
4.1质粒载体 86
4.1.1质粒的一般生物学特性 86
4.1.2质粒DNA的复制与拷贝数的控制 89
4.1.3质粒DNA的分离与纯化 91
4.1.4质粒载体的构建及类型 92
4.1.5重要的大肠杆菌质粒载体 95
4.1.6质粒载体的稳定性问题 99
4.2噬菌体载体 100
4.2.1噬菌体的一般生物学特性 100
4.2.2 λ噬菌体载体 103
4.2.3单链DNA噬菌体载体 107
4.3柯斯质粒载体 112
4.3.1柯斯质粒载体的构建及其特点 112
4.3.2柯斯克隆 113
4.3.3柯斯克隆的改良 114
4.4噬菌粒载体 116
4.4.1噬菌粒载体的概念 116
4.4.2 pUC118和pUC119噬菌粒载体 117
4.4.3 pBluescript噬菌粒载体 118
4.5人工染色体克隆载体 119
4.5.1构建大容量载体的必要性 119
4.5.2人工染色体的必需成分 120
4.5.3酵母人工染色体载体 120
4.5.4细菌人工染色体载体 122
4.5.5 P1人工染色体 123
4.5.6人类人工染色体 123
4.5.7植物人工染色体 124
思考题 124
参考文献 125
第5章 目的基因的获取与改造 126
5.1 DNA的人工合成 126
5.1.1人工合成DNA的原理 126
5.1.2人工合成DNA的应用 128
5.2从基因文库获取目的基因 130
5.2.1基因组文库的构建与筛选 130
5.2.2 cDNA文库的构建与筛选 136
5.2.3基因组文库与cDNA文库的区别 140
5.3 PCR技术与目的基因的分离 141
5.3.1目的基因的直接扩增和克隆 141
5.3.2目的基因的cDNA的克隆 141
5.4电子克隆获取目的基因 141
5.4.1电子克隆的基本原理 142
5.4.2利用EST数据库进行电子克隆 142
5.4.3利用基因组数据库进行电子克隆 143
5.4.4全长cDNA的判断 143
5.5根据基因差异表达获得目的基因 143
5.5.1 mRNA差异显示技术 143
5.5.2 cDNA代表性差异分析 145
5.5.3抑制差减杂交技术 145
5.6目的基因的改造 147
5.6.1基因突变与人工诱变技术 147
5.6.2基因定点诱变 149
5.6.3基因随机突变 151
思考题 153
参考文献 153
第6章 目的基因的导入与重组体的鉴定 155
6.1重组DNA向原核细胞的导入 155
6.1.1原核受体细胞的种类及特点 155
6.1.2转化 156
6.1.3重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 157
6.1.4重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 160
6.2重组DNA导入真核细胞 161
6.2.1真核受体细胞 161
6.2.2重组DNA分子导入酵母细胞 162
6.2.3重组DNA分子导入植物细胞 162
6.2.4重组DNA分子导入哺乳动物细胞 164
6.3重组体克隆的筛选与鉴定 167
6.3.1载体遗传标记筛选法 167
6.3.2依赖于重组子结构特征分析的筛选法 171
6.3.3核酸分子杂交检测法 172
6.3.4免疫化学检测法 174
6.3.5翻译筛选法 175
6.3.6亚克隆法 176
6.3.7插入失活法 176
6.3.8电子显微镜作图检测法 177
6.3.9转录产物作图 177
6.3.10基因表达产物分析法 177
6.3.11 DNA序列测定法 178
思考题 179
参考文献 179
第7章 外源基因的原核表达系统 180
7.1原核表达系统的特点 180
7.1.1原核生物的转录 180
7.1.2原核生物的翻译 181
7.2原核细胞表达体系 182
7.2.1大肠杆菌表达体系 182
7.2.2芽孢杆菌表达体系 185
7.2.3链霉菌表达体系 186
7.2.4蓝藻表达体系 188
7.3提高外源基因表达水平的措施 190
7.3.1优化表达载体的设计 190
7.3.2避免使用稀有密码子 190
7.3.3提高外源基因mRNA的稳定性 190
7.3.4提高表达蛋白的稳定性，防止其降解 191
7.3.5减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平 191
7.3.6优化发酵条件 191
7.4利用原核细胞生产真核蛋白质的实例 191
7.4.1干扰素基因工程 191
7.4.2生长激素基因工程 192
7.4.3生长激素释放抑制因子基因工程 193
7.4.4胰岛素基因工程 194
7.4.5 α-淀粉酶基因工程 195
7.5目的蛋白的纯化 197
7.5.1组氨酸标签 197
7.5.2 GST-标签 198
7.5.3 MBP标签 199
7.5.4 IMPACT 199
7.5.5 TAP-标签 200
思考题 201
参考文献 201
第8章 外源基因的真核表达系统 202
8.1真核细胞表达体系的特点 202
8.1.1利用真核细胞作宿主系统的优点 202
8.2酵母表达系统 203
8.2.1酵母基因表达载体的构成 203
8.2.2酵母基因表达载体的种类 204
8.2.3酵母基因表达系统宿主菌 207
8.2.4在酵母中高效表达外源基因的策略 207
8.3昆虫或昆虫细胞表达体系 208
8.3.1以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系 209
8.3.2杆状病毒表达系统的效率与加工能力 209
8.3.3一类稳定转化的昆虫表达系统 211
8.4哺乳动物细胞基因表达系统 212
8.4.1哺乳动物基因表达载体的组成特征 213
8.4.2哺乳动物基因表达载体 214
8.4.3哺乳动物基因表达宿主细胞 220
8.4.4提高哺乳动物基因表达系统表达效率的因素 221
思考题 221
参考文献 222
第9章 转基因动物 223
9.1转基因动物发展简史 223
9.2转基因动物技术 225
9.2.1外源基因导入动物细胞的方法 225
9.2.2转基因动物技术的新发展 234
9.3转基因动物的制备和检测 240
9.3.1以显微注射小鼠为例介绍转基因动物的制备 240
9.3.2转基因的鉴定和表达水平检测 241
9.4转基因动物研究中出现的问题及其对策 243
9.4.1转基因动物效率极低 243
9.4.2难以控制转基因在寄主基因组的行为 244
9.4.3大部分转基因表达水平极低 244
9.4.4转基因表达特征及提高转基因表达的策略 245
9.5转基因动物的应用 246
9.5.1在生产和生活中的应用 246
9.5.2在生物制药方面的应用——动物生物反应器 247
9.5.3在疾病研究中的应用 249
9.5.4在基础研究中的应用 250
9.6转基因动物的安全性及其未来 250
9.6.1食品安全性 251
9.6.2环境安全性 251
思考题 252
参考文献 252
第10章 转基因植物 254
10.1转基因植物概述 254
10.2转基因植物的基因转化方法 255
10.2.1转基因植物受体系统 255
10.2.2农杆菌介导的植物基因转化技术 256
10.2.3 DNA直接导入的基因转化技术 262
10.2.4花粉管通道法介导的基因转化技术 264
10.3转基因植物的检测方法 265
10.3.1基于报告基因/选择标记基因的转基因植物检测方法 265
10.3.2基于报告基因的转基因植物的外源基因表达检测 266
10.3.3外源目的基因整合的鉴定 267
10.4抗虫转基因植物 268
10.4.1来源于微生物的抗虫基因 268
10.4.2来源于植物的抗虫基因的应用 270
10.5抗细菌转基因作物 272
10.5.1裂解细菌细胞壁 272
10.5.2破坏细菌细胞膜 273
10.5.3解除细菌毒素的毒性作用 274
10.5.4引入对细菌毒素不敏感的靶酶 274
10.5.5增强植物本身的防卫蛋白合成 274
10.6抗病毒转基因作物 275
10.6.1利用非病毒来源的抗病毒基因策略 275
10.6.2利用病毒来源基因的抗病毒策略 276
10.7抗除草剂转基因作物 279
10.7.1增加靶标酶或靶标蛋白的拷贝数 279
10.7.2作用靶标酶的修饰 279
10.7.3分离能解除除草剂毒性的酶基因 280
10.7.4新型除草剂的发展方向 280
10.8抗逆境转基因作物 280
10.8.1抗干旱胁迫策略 280
10.8.2抗寒冻胁迫策略 281
10.8.3抗盐碱胁迫策略 282
10.9植物生物反应器 282
10.9.1植物生物反应器的优点 282
10.9.2植物生物反应器的研究现状 283
10.9.3植物生物反应器存在的问题 283
10.10转基因沉默的原因及对策 284
10.10.1转基因沉默的原因 284
10.10.2控制转基因沉默的策略 285
10.11转基因植物的安全性评价 285
10.11.1转基因植物食品的安全性评价 286
10.11.2转基因植物生态环境的安全性评价 288
思考题 290
参考文献 290
第11章 基因治疗 291
11.1基因治疗的基本概念 291
11.2基因治疗的发展简史与现状 291
11.3基因治疗的策略 294
11.3.1根据基因导入体内的方式 294
11.3.2根据导入基因发生作用的方式 295
11.4基因治疗的流程 295
11.4.1目的基因的准备 295
11.4.2靶细胞 295
11.4.3载体的选择 295
11.4.4转移技术 296
11.5基因治疗的应用 304
11.5.1肿瘤的基因治疗 305
11.5.2单基因病的基因治疗 312
11.5.3艾滋病等感染性疾病的基因治疗 315
11.6基因治疗的前景 316
11.6.1基因治疗面临的问题和挑战 316
11.6.2基因治疗的发展方向 317
思考题 317
参考文献 317
第12章 合成生物学与基因工程 319
12.1合成生物学 319
12.1.1合成生物学的定义 319
12.1.2合成生物学的研究内容 320
12.1.3合成生物学的工程本质 325
12.1.4合成生物学的意义 327
12.1.5合成生物学的应用 328
12.2合成生物学与基因工程 331
12.2.1合成生物学与基因工程的差异 332
12.2.2合成生物学与基因工程相似之处 333
思考题 334
参考文献 334
附录 总复习题 335