目 录 1
谈序 1
第一章载体—宿主系统 1
质粒 1
施序 2
译者的话 3
前言 4
用质粒进行的克隆 8
λ噬菌体 11
裂解性生长周期 14
溶源性 15
λ噬菌体载体的构建 16
合适载体的选择 17
λ噬菌体载体的图谱 18
柯斯质粒 36
单链噬菌体 40
小结 42
第二章 细菌菌株和病毒的增殖与保存 44
菌株的鉴定 44
单菌落的分离 44
细菌菌株的生长、保持和保藏 46
λ噬菌体噬斑的纯化 46
从单噬斑制备λ噬菌体纯种 47
液体培养基 49
培养基和抗生素 49
含琼脂或琼脂糖的培养基 50
抗生素 51
第三章λ噬菌体和质粒DNA的分离 53
λ噬菌体的大量制备 53
感染 53
诱导（Pirrotta et al.,1971） 54
λ噬菌体的纯化（Yamamoto et al.,1970） 55
λ噬菌体DNA的抽提 58
质粒DNA的大量分离 58
细菌的生长和质粒的扩增 59
细菌的收集和裂解 59
用氯化铯—溴化乙锭等密度平衡离心和提纯闭环DNA 61
质粒DNA制剂中RNA的去除 62
第四章用于分子克隆的酶 64
限制性内切酶 64
同切口限制性内切酶 64
甲基化作用 67
用限制性核酸内切酶酶切DNA 68
用于分子克隆的其他酶类 69
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 70
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段 73
T4 DNA聚合酶 75
用T4多核苷酸激酶标记DNA5′末端 78
依赖于RNA的DNA聚合酶 82
DNA的去磷酸化 84
核酸酶Bal31 85
SI核酸酶 88
绿豆核酸酶（绿豆种子） 88
核糖核酸酶 88
脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ） 89
核酸外切酶Ⅶ 89
核酸外切酶Ⅲ 90
λ核酸外切酶 91
Poly（A）聚合酶 91
T4 DNA连接酶 92
T4 RNA连接酶 92
脱氧核糖核苷末端转移酶（末端转移酶） 93
EcoRI甲基化酶 93
第五章 凝胶电泳 95
琼脂糖凝胶电泳 95
凝胶电泳槽 96
缓冲液 98
琼脂糖凝胶的制备 98
琼脂糖凝胶中DNA的染色 100
照相 102
微型凝胶电泳 102
琼脂糖凝胶中DNA的回收 102
碱性琼脂糖凝胶 105
聚丙烯酰胺凝胶电泳 106
聚丙烯酰胺凝胶的制备 107
聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的分离（Maxam and Gilbert 1977） 109
链分离凝胶 109
聚丙烯酰胺凝胶中的链分离 110
琼脂糖凝胶中DNA的链分离 111
用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行短双链DNA的链分离 111
第六章真核细胞中mRNA的抽提、纯化与分析 114
哺乳动物细胞中mRNA的分离 115
细胞总RNA的分离 117
Poly（A）+RNA的筛选 118
RNA凝胶电泳 119
RNA的核酸酶－S1酶切制图法 123
cDNA第一链的合成 125
cDNA的合成 125
第七章 cDNA的合成与克隆 125
cDNA第二链的合成 127
发夹环的核酸酶S1切割 127
双链cDNA的分子克隆 127
同聚尾接法 128
DNA接头的合成 129
cDNA克隆的其他方法 130
cDNA克隆的策略 132
高丰度mRNAs 132
低丰度mRNAs 132
cDNA的克隆程序 135
双链cDNA的合成 135
用核酸酶S1的酶切 138
双链cDNA的克隆 140
载体和双链cDNA的退火 142
双链cDNA克隆的顺序添加接头法 142
第八章质粒和λ噬菌体DNA引入大肠杆菌 145
质粒DNA在大肠杆菌中的转化 145
用氯化钙转化的程序 145
用氯化钙／氯化铷转化的程序 146
大肠杆菌x1776的转化 147
λ噬菌体DNA的体外包装 148
λ噬菌体溶源菌的保存和检测 149
包装提取物的制备方法Ⅰ 150
体外包装方法Ⅰ 151
包装抽提物的制备方法Ⅱ 152
体外包装方法Ⅱ 154
第九章 基因库的构建 155
用λ噬菌体作载体构建基因库 155
载体DNA的制备 157
用组织培养细胞分离高分子量的真核DNA(Blim and Stafford 1976) 160
真核DNA20kb片段的制备 161
连接和包装 163
基因库的扩增 167
用柯斯载体构建基因库 167
用经磷酸酶处理的柯斯载体进行的克隆 168
用两种限制酶酶切和磷酸酶处理的柯斯载体进行的克隆 170
柯斯质粒基因库的扩增、保存及筛选 173
细菌菌落和噬菌体的原位杂交 176
第十章重组克隆系的鉴定 176
少量细菌菌落的筛选 177
菌落在硝酸纤维素滤膜上的影印 178
杂交筛选λ噬菌斑（Benton and Davis 1977） 180
λ噬菌斑原位扩增后的杂交筛选 181
固定于滤膜的DNA或RNA与放射性探针杂交 182
印染在硝酸纤维素滤膜上的噬菌斑或菌落杂交 183
用杂交筛选鉴定cDNA克隆株 184
利用固定于硝酸纤维素滤膜上的DNA进行杂交选择 185
杂交选择的RNA在网质红细胞裂解物中的翻译 190
注入蛙卵母细胞内mRNA的翻译 193
重组选择的原理 195
通过大肠杆菌细胞内重组筛选λ噬菌体基因库中特定的DNA序列 195
用于πVX质粒筛选的菌株 197
πVX的制备 198
W3110r-m+（P3）的转化 198
将λ噬菌体基因库涂布于W3110r-m+（P3）（πVX）菌 198
含有抑制基因噬菌体的遗传学检测法 198
πVX系统的检测 198
πVX系统的应用 200
第十一章重组DNA克隆系的分析 202
质粒DNA及λ噬菌体DNA的快速分离 202
质粒DNA的少量快速分离 202
λ噬菌体DNA的少量快速分离 204
限制性核酸内切酶切点图谱的制作 205
顺序式酶切 206
用单酶切或多酶切作图 206
部分酶切 207
索氏吸印（Southern）转移 209
DNA从琼脂糖凝胶向硝酸纤维素滤膜的转移 209
索氏滤膜的杂交 211
小片段DNA在质粒载体中的次级克隆 212
具粘性末端的DNA片段的次级克隆 213
在次级克隆中使用合成的DNA接头 213
通过平头末端DNA片段连接产生限制酶切点 216
克隆步骤的快速连续法 217
启动子 219
第十二章大肠杆菌中表达克隆化DNA的载体 219
使用λ噬菌体PL启动子的载体 220
其他启动子 222
核糖体结合位点 222
真核基因的表达 223
表达非融合性真核蛋白的载体 223
表达融合性真核蛋白的载体 229
克隆化基因的高效表达 235
增加基因的剂量 235
小结 235
玻璃和塑料器皿 237
有机试剂的制备 237
附录A生物化学技术 237
液体培养基 238
用于λ噬菌体操作的溶液 239
抗生素 239
缓冲液和溶液的配制 240
蛋白水解酶 242
酶 243
限制性核酸内切酶酶切缓冲液 244
常用的电泳缓冲液 244
常用凝胶上样缓冲液 244
32P标记核苷酸乙醇水混合液的干燥浓缩 245
核酸的纯化 245
透析袋的预处理 245
核酸的浓缩 246
Sephadex G-50层析 248
DNA和RNA的定量 249
放射自显影 250
核酸放射活性的测定 252
作分子量标记的多体质粒的制备 252
Mavam-Gilbert序列测定技术 253
附录B pBR322 256
pBR322的核苷酸序列 256
pBR322的限制酶切点 260
pBR322DNA的限制性片段 265
附录C常用细菌菌株 274
参考文献 276