1 基因工程的分子生物学基础 1
1．1 遗传信息的传递和分子生物学的中心法则 1
1．2 DNA分子的复制 3
1．2．1 DNA分子复制的一般特点 3
1．2．2 DNA聚合酶 6
1．2．3原核和真核复制子和复制的调控 8
1．3 原核和真核生物基因结构的特征 15
1．4 RNA的转录和RNA的加工 16
1．4．1RNA合成的基本特征 16
1．4．2 RNA聚合酶 17
1．4．3 与转录调控有关的DNA序列 18
1．4．4 RNA的转录 20
1．4．5 RNA转录后加工 24
1．5 逆转录和逆转录酶 32
1．6 翻译——蛋白质的生物合成 34
1．6．1 遗传密码 34
1．6．2参与蛋白质生物合成的生物大分子及其功能 37
1．6．3 蛋白质生物合成的过程 42
1．6．4蛋白质翻译后的修饰和加工 47
1．6．5蛋白质的折叠 48
1．6．6分子伴侣和折叠酶 49
1．6．7细胞内蛋白质折叠的路径 54
1．6．8蛋白质的剪接 58
1．7基因表达的调控 62
1．7．1 原核基因表达的调控 63
1．7．2真核基因表达的调控 67
参考文献 82
2 基因工程的四大要素及实施要点 85
2．1基因工程操作中常用的工具酶 85
2．1．1限制性内切酶和甲基化酶 85
2．1．2连接酶 87
2．1．3用于基因工程中的修饰酶 88
2．2 基因的分离 90
2．2．1基因分离的物理化学方法 90
2．2．2鸟枪法分离基因 90
2．2．3cDNA文库的建立与基因的分离 90
2．2．4 直接从特定的mRNA分离基因 94
2．2．5 基因组文库的建立和基因的分离 94
2．2．6 从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因 94
2．2．7基因的化学合成 95
2．2．8利用PCR或RT-PCR分离基因 97
2．3基因工程载体 97
2．3．1质粒载体 98
2．3．2λ噬菌体载体 103
2．3．3 粘质粒载体 106
2．3．4 M13噬菌体载体及噬菌粒 107
2．3．5 真核细胞用载体 110
2．3．6人工染色体 112
2．4受体细胞和重组基因的导入 114
2．5 基因重组的方法 116
2．6 基因重组体的筛选 120
参考文献 124
3外源基因在宿主细胞中的高效表达 125
3．1有效的转录起始与基因的高效表达 125
3．2 mRNA的有效延伸和转录终止与基因的高效表达 126
3．3 mRNA的稳定性与基因的高效表达 127
3．4有效的翻译起始与基因的高效表达 127
3．5 遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达 128
3．6 mRNA的二级结构与基因的高效表达 131
3．7RNA的加工与基因的高效表达 131
3．8 mRNA序列上终止密码的选择 131
3．9表达质粒（或载体）的拷贝数及稳定性与基因的高效表达 132
3．10外源蛋白的稳定性与基因的高效表达 132
参考文献 133
4 基因的融合和融合蛋白的表达 134
4．1利用基因融合技术表达外源基因的缘由 134
4．2基因融合的策略 134
4．3基因融合和重组蛋白的产生 136
4．4基因融合和显示筛选 137
4．5 基因融合和蛋白分泌 137
4．6融合蛋白的纯化 138
4．7融合蛋白的位点特异性切割 138
参考文献 139
5 外源蛋白的分泌表达 141
5．1外源基因在E.coli中的分泌表达 141
5．2外源基因在枯草杆菌中的分泌表达 143
5．3α-因子前导序列介导的酵母细胞分泌系统 144
参考文献 146
6 重组蛋白的正确折叠及修饰 147
6．1重组蛋白的可溶性表达和折叠 147
6．2 重组蛋白的重折叠 149
6．3外源蛋白在翻译后的修饰 151
参考文献 151
7几种真核细胞表达系统 153
7．1COS细胞瞬时表达系统及其应用 153
7．2哺乳动物细胞稳定表达系统 157
7．3外源基因在哺乳动物细胞中的组成性表达和诱导性表达 160
7．4核型多角体病毒为载体的昆虫（细胞）表达系统 161
7．4．1构建核型多角病毒载体的原理 162
7．4．2转移载体质粒的构建 163
7．4．3重组病毒的组建和筛选 165
7．4．4产生重组病毒的新策略 166
7．4．5对NPV/昆虫（细胞）表达系统的评估 169
7．5 关于转基因动物 170
参考文献 171
8 分子杂交技术 173
8．1探针与目标核酸相互作用的原理 173
8．2 探针的选择和特异性 175
8．3 杂交的速率与探针长度、浓度及杂交加速剂的关系 176
8．3．1杂交的速率与探针长度及复杂性 176
8．3．2杂交速率与探针的浓度 176
8．3．3杂交的加速剂和杂交速率 177
8．4 杂交的最适条件 178
8．5 放射性探针的制备 179
8．5．1双链DNA探针的制备 179
8．5．2单链DNA探针的制备 181
8．5．3单链RNA探针的制备 181
8．5．4产生杂交探针的其他方法 183
8．5．5选择放射性同位素的原则 183
8．5．6标记探针的比放射活度测定 184
8．5．7放射性标记探针的纯化 185
8．6非放射性探针的制备 185
8．7 放射性和非放射性标记探针的应用范围 188
参考文献 189
9 粒子轰击和基因转移 191
参考文献 193
10 聚合酶链反应及其应用 194
10．1 聚合酶链反应的原理 194
10．2标准的PCR扩增方案 194
10．3对PCR反应中几种主要组成的分析 195
10．4与PCR相关的技术及PCR技术的应用 201
参考文献 207
11 噬菌体显示技术 208
11．1两类表达载体 208
11．2噬菌体显示技术的操作 209
11．3 噬菌体显示技术的应用 210
参考文献 212
12 基因打靶技术及其应用 213
12．1 同源重组与基因打靶 213
12．2基因打靶载体 213
12．3影响基因打靶效率的因素 215
12．4转染DNA的方法及重组体的检定 215
12．5基因打靶技术的应用 218
参考文献 219
13DNA序列分析 220
13．1 Sanger的双脱氧链终止测序法 220
13．2Maxam-Gilbert DNA 化学降解法 223
13．3 关于变性聚丙烯酰胺测序凝胶 224
参考文献 224
14 基因突变 225
14．1 寡核苷酸介导的基因突变 225
14．1．1寡核苷酸介导的基因突变的操作步骤 225
14．1．2寡核苷酸介导的基因突变中应注意的各种因素 225
14．1．3 几种寡核苷酸介导的基因突变的方法 229
14．2盒式突变法 235
14．3利用PCR进行DNA序列的突变 236
14．4关于随机突变 240
14．4．1利用化学试剂进行的随机突变 241
14．4．2酶法随机错误掺入突变法 241
14．4．3其他产生随机突变的方法 243
参考文献 243
15寡核苷酸的化学合成 245
15．1寡核苷酸片段固相合成的原理及步骤 245
15．1．1用于寡核苷酸化学合成的单体 245
15．1．2用于寡核苷酸化学合成的固相载体 246
15．1．3 寡核苷酸片段合成的步骤 246
15．2寡核苷酸片段的纯化及检定 250
15．2．1寡核苷酸片段从固相载体上切离和去保护基 250
15．2．2 寡核苷酸片段的脱盐 250
15．2．3寡核苷酸片段合成产率的估计 250
15．2．4寡核苷酸片段的纯化 251
15．2．5DNA寡核苷酸片段的检定 252
16 几种有开发前景的研究 253
16．1转录因子的研究与治疗药物的开发 253
16．2真核细胞受体的克隆和表达为药物开发提供了新思路 253
16．3反义核酸技术 254
16．4DAN疫苗 254
参考文献 255
17 蛋白质工程概述 256
参考文献 259