1基因工程概述 1
目 录 1
1.1基因工程概貌 2
1.1.1基因工程的诞生和兴起 2
1.1.2基因工程的特点与基本步骤 4
1.1.3基因工程早期的开创性研究成就 6
1.2基因工程技术的应用与发展趋势 8
1.2.1全球性的基因工程争夺战 8
1.2.2蛋白质工程的研究开发飞速发展 11
1.2.3转基因动植物生产药物的研究迅速崛起 12
1.2.4 医学科学研究取得巨大成就 13
1.2.5基因治疗技术取得重大进展 13
1.2.6规模空前的国际《人类基因组计划》提前完成 14
1.3.1 基因工程制药发展态势 15
1.3基因工程与生物制药 15
1.3.2主要基因工程药物简介 16
2基因工程常用的工具酶 21
2.1限制性核酸内切酶 21
2.1.1限制酶的发现 21
2.1.2限制酶的种类 22
2.1.3限制酶的命名 23
2.1.4 Ⅱ型限制酶的特性 23
2.1.5限制片段末端连接 27
2.2 DNA连接酶 27
2.2.1 DNA连接酶连接作用的特点 27
2.2.2基因工程中常用的连接酶 29
2.3 DNA聚合酶 30
2.2.3 DNA连接酶连接作用的分子机理 30
2.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 31
2.3.2 Klenow大片段酶 33
2.3.3 T4噬菌体DNAR聚合酶 33
2.3.4经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶 34
2.3.5 TaqDNA聚合酶及Ampli TaqTMDNA聚合酶 34
2.3.6反转录酶 35
2.4 DNA修饰酶 36
2.4.1末端脱氧核苷酸转移酶 36
2.4.2碱性磷酸酶 36
2.4.3 T4噬菌体多核苷酸激酶 37
2.5.1 S1核酸酶 38
2.5.2 Ba131核酸酶 38
2.5单链核酸内切酶 38
2.6核酸外切酶 39
2.6.1核酸外切酶Ⅶ 39
2.6.2核酸外切酶Ⅲ 40
2.6.3λ核酸外切酶 40
3基因工程常用的克隆载体 41
3.1质粒载体 41
3.1.1质粒概述 41
3.1.2质粒DNA分子的特性 43
3.1.3质粒载体的改造和构建 47
3.1.4 pBR322质粒载体 49
3.1.5 pUC质粒载体 53
3.1.6其他重要的质粒载体 55
3.2.1λ噬菌体的基本特性 57
3.2λ噬菌体载体 57
3.2.2λ噬菌体基因组的结构与功能 59
3.2.3λ噬菌体载体的构建 61
3.2.4常用的λ噬菌体载体 64
3.2.5改良型λ噬菌体载体 68
3.3粘粒载体 70
3.3.1粘粒载体的构建 70
3.3.2粘粒载体的特点 70
3.3.3常用的粘粒载体 71
3.4 M13噬菌体载体 73
3.4.1 M13噬菌体的基本特性 73
3.4.2 M13噬菌体载体的构建 74
3.5.1 pUC118和pUC119噬菌粒载体 77
3.5噬菌粒载体 77
3.4.3 M13噬菌体载体系列的优点 77
3.5.2 pBluescript噬菌粒载体 78
3.6哺乳动物细胞载体系统 80
3.6.1 SV40载体 80
3.6.2牛乳头瘤病毒（BPV）载体 80
3.6.3 EBV病毒载体 81
4目的基因的制取 82
4.1 目的基因的化学合成 82
4.1.1 目的基因的设计 82
4.1.2寡聚核苷酸片段的合成 83
4.1.3寡核苷酸片段的分离和纯化 84
4.1.4用寡核苷酸片段组装目的基因 85
4.1.5化学合成寡核苷酸的其他用途 86
4.2.2真核基因组DNA文库的构建过程 87
4.2构建基因文库法分离目的基因 87
4.2.1构建基因文库法分离目的基因的基本步骤 87
4.3酶促合成法制取目的基因 91
4.3.1 真核生物细胞中的mRNA 91
4.3.2 从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA 91
4.3.3 RT-PCR法合成目的cDNA 97
5目的基因与克隆载体的体外重组 101
5.1 目的基因与质粒载体的连接 101
5.1.1粘性末端连接法 101
5.1.2定向克隆法 104
5.1.3平末端连接法 107
5.1.4同聚物加尾法 107
5.1.5加人工接头连接法 109
5.1.6加DNA衔接物连接法 110
5.2目的基因与λ噬菌体载体的连接 112
5.1.7其他转换末端形式连接法 112
5.2.1 λ噬菌体载体臂DNA的制备 113
5.2.2λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接 114
6重组克隆载体引入受体细胞 115
6.1基因工程受体细胞 115
6.1.1 受体细胞的特性 115
6.1.2重组体分子导入受体细胞的途径 116
6.2重组体DNA分子的转化或转染 117
6.2.1 用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法 117
6.2.2用复合剂制备感受态细胞转化法 118
6.2.3 高压电穿孔转化法（电转化法） 118
6.3重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导 119
6.3.1λ噬菌体体外包装的基本原理 119
6.3.3 包装提取物的制备 120
6.3.2λ噬菌体DNA的体外包装 120
6.3.4 重组λDNA的体外包装与感染方法 121
6.4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染 122
6.4.1 磷酸钙和DNA共沉淀物转染法 122
6.4.2 DEAE－葡聚糖介导转染法 122
6.4.3 利用Polybrene（聚季铵盐）的DNA转染法 122
6.4.4利用原生质体融合的DNA转染法 123
6.4.5 电穿孔法DNA转染 123
7含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析 124
7.1重组体（菌）的筛选 124
7.1.1 抗生素抗性基因插入失活法 124
7.1.2 β－半乳糖苷酶基因插入失活法 124
7.1.3快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法 125
7.1.4放射性标记核酸探针杂交筛选法 126
7.1.5免疫化学筛选法 135
7.2重组体的鉴定 136
7.2.1酶切及凝胶电泳鉴定法 137
7.2.2 Southern印迹杂交法 138
7.2.3电镜R－环检测法 140
7.2.4基因产物鉴定法 140
7.3重组DNA的序列分析 141
7.3.1 Sanger双脱氧链终止法DNA测序 141
7.3.2 Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序 144
7.3.3快速自动化DNA测序 146
8.1外源目的基因在原核细胞中的表达 148
8.1.1原核基因表达载体的构成 148
8目的基因在宿主细胞中的表达 148
8.1.2常见的原核细胞表达载体系统 152
8.1.3 外源目的基因在原核细胞的表达形式 153
8.1.4在原核细胞中高效表达目的基因 155
8.1.5基因定点诱变技术 157
8.2外源目的基因在真核细胞中的表达 161
8.2.1真核细胞表达载体的功能元件 162
8.2.2酵母菌表达系统 164
8.2.3哺乳动物细胞表达系统 166
9基因工程药物无性繁殖系的组建 170
9.1人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建 170
9.1.1 重组表达质粒pJG202的构建与鉴定 170
9.2.1 hIFN-α2b基因的获得 171
9.2.2重组表达质粒pMZI2B的构建 171
9.1.3融合蛋白后处理成为人胰岛素原 171
9.2人α2b型干扰素工程菌的组建 171
9.1.2重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达 171
9.2.3人α2b型干扰素工程菌的形成与基因的表达 172
9.3集落刺激因子工程菌的组建 173
9.3.1 细胞总RNA的提取 173
9.3.2 PCR引物的设计与合成 173
9.3.3 RT-PCR法制备GM-CSF cDNA 173
9.3.4 GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建 173
9.4白细胞介素融合蛋白工程菌的组建 174
9.4.1质粒与PCR引物 174
9.4.2人IL-2 cDNA和PE基因的末端改造 175
9.4.3 IL2-PE-pLY5重组质粒的构建 175
9.5.3重组表达质粒在酵母细胞中的稳定性 176
9.5.2重组表达质粒的转化及HBsAg的表达 176
9.5.1 BsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建 176
9.5乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建 176
9.6人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建 177
9.6.1真核表达质粒pLFrGGI的构建 178
9.6.2 高效表达FrGGI（tPA突变体）的CHO细胞株的获得 178
9.6.3去除dhfr基因转录增强子的作用 178
9.7红细胞生成素CHO细胞株的组建 179
9.7.1质粒与细胞株 179
9.7.2 EPO真核重组表达质粒pMGL4的构建 179
9.7.3重组表达质粒转染COS-7细胞及产物表达 179
9.7.4重组表达质粒转染CHO-dhfr－细胞及EPO表达 179
9.8人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建 180
9.8.1 含hTNF-α基因的重组质粒的构建 181
9.8.3重组病毒感染Sf21细胞及hTNF-α的表达 182
9.8.2共转染与重组病毒的获得 182
10基因工程药物的生产 183
10.1基因工程菌（细胞）的培养与发酵 183
10.1.1 工程细菌的培养与发酵 183
10.1.2工程酵母的培养与发酵 185
10.1.3工程细胞的培养与发酵 185
10.2基因工程药物的分离纯化 186
10.2.1 影响分离纯化工艺设计的主要因素 187
10.2.2各种产物表达形式采用的分离纯化方法 187
10.3基因工程药物的分离纯化实例 189
10.3.1 以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化 189
10.3.2以分泌型表达的人α1－干扰素的分离纯化 191
10.3.3以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化 191
10.3.4在酵母中表达的HBsAg的分离纯化 192
11.1.1 主要的基因工程药物 194
11基因工程药物的检验 194
11.1基因工程药物的质量控制 194
11.1.2基因工程药物的特点 195
11.1.3基因工程药物的质量要求 195
11.1.4基因工程药物的质控要点 196
11.1.5基因工程药物的制造及检定规程 200
11.2基因工程药物常用的检验方法 202
11.2.1化学检定法 202
11.2.2肽图分析法 202
11.2.3 外源性DNA残留量的测定 203
11.2.4宿主细胞蛋白杂质的检测 204
11.2.5无菌试验 205
11.2.6内毒素试验 208
11.2.7异常毒性试验 209
11.2.8热原质试验 210
11.2.9生物学活性（效价）检定 211
11.3主要基因工程药物的检验 211
11.3.1重组人胰岛素的检验 211
11.3.2重组人生长激素的检验 213
11.3.3重组人干扰素的检验 215
11.3.4重组人白细胞介素的检验 217
11.3.5重组人红细胞生成素的检验 218
11.3.6重组人集落刺激因子的检验 219
11.3.7重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验 221
11.3.8重组人肿瘤坏死因子的检验 222
11.3.9重组乙型肝炎疫苗的检验 222
附录 224
参考文献 230