1概述 3
1.1基因工程的基本概念 3
1.1.1基因工程的基本定义 3
1.1.2基因工程的基本过程 3
1.1.3基因工程的基本原理 3
1.1.4基因工程的基本体系 4
1.2基因工程的发展历史 6
1.2.1基因工程的诞生 6
1.2.2基因工程的成熟 7
1.2.3基因工程的腾飞 8
1.3基因工程的研究意义 8
1.3.1第四次工业大革命 8
1.3.2第二次农业大革命 9
1.3.3第四次医学大革命 10
2 DNA重组克隆单元操作 13
2.1 DNA重组的载体 13
2.1.1质粒载体 13
2.1.2 λ双链噬菌体DNA载体 18
2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体 23
2.1.4噬菌体质粒杂合载体 25
2.1.5人造染色体载体 27
2.2 DNA的体外重组（切与接） 27
2.2.1限制性核酸内切酶 28
2.2.2 T4-DNA连接酶 33
2.2.3其他用于DNA重组的工具酶 35
2.2.4 DNA切接反应的影响因素 38
2.2.5 DNA分子重组的方法 41
2.3重组DNA分子的转化与扩增（转与增） 50
2.3.1重组DNA转化的基本概念 50
2.3.2受体细胞的选择 51
2.3.3转化方法 53
2.3.4转化率及其影响因素 56
2.3.5转化细胞的扩增 58
2.4转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 58
2.4.1基于载体遗传标记的筛选与鉴定 58
2.4.2基于克隆片段序列的筛选与鉴定 61
2.4.3基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 75
2.5目的基因的克隆 77
2.5.1鸟枪法 78
2.5.2 cDNA法 81
2.5.3 PCR扩增法 89
2.5.4化学合成法 95
2.5.5基因文库的构建 98
3大肠杆菌基因工程 107
3.1外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理 107
3.1.1启动子 107
3.1.2终止子 112
3.1.3 SD序列 112
3.1.4密码子 113
3.1.5质粒拷贝数 115
3.2大肠杆菌工程菌的构建策略 116
3.2.1包含体型异源蛋白的表达 117
3.2.2分泌型异源蛋白的表达 120
3.2.3融合型异源蛋白的表达 124
3.2.4寡聚型异源蛋白的表达 129
3.2.5整合型异源蛋白的表达 132
3.2.6蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 133
3.3重组异源蛋白的体外复性活化 136
3.3.1包含体的溶解与变性 136
3.3.2异源蛋白的复性与重折叠 138
3.4大肠杆菌工程菌培养的最优化控制 142
3.4.1细菌生长的动力学原理 143
3.4.2发酵过程的最优化控制 145
3.4.3大肠杆菌工程菌的高密度发酵 148
3.5基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 150
3.5.1工程菌遗传不稳定性的表现与机制 150
3.5.2改善工程菌不稳定性的对策 152
3.6利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 154
3.6.1胰岛素的结构及其生物合成 155
3.6.2人胰岛素的生产方法 156
3.6.3产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略 156
4酵母基因工程 163
4.1酵母的受体系统 163
4.1.1提高重组异源蛋白产率的突变型受体 163
4.1.2抑制超糖基化作用的突变型受体 164
4.1.3减少泛素依赖型蛋白质降解作用的突变型受体 165
4.1.4内源性蛋白酶缺陷型的突变型受体 166
4.2酵母的载体系统 166
4.2.1酿酒酵母中的2μ环状质粒 166
4.2.2乳酸克鲁维酵母中的线状质粒 167
4.2.3果蝇克鲁维酵母中的环状质粒 168
4.2.4含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建 168
4.2.5含有CEN的YCp载体及其构建 169
4.2.6含有TEL的YAC载体及其构建 170
4.3酵母的转化系统 172
4.3.1酵母的转化程序 172
4.3.2转化质粒在宿主细胞中的命运 173
4.3.3用于转化子筛选的标记基因 174
4.4酵母的表达系统 176
4.4.1酵母启动子的基本特征与选择 176
4.4.2酵母启动子的可调控表达系统 177
4.4.3外源基因在酵母中表达的限制性因素 179
4.4.4酵母表达系统的选择 180
4.5酵母的蛋白质修饰分泌系统 184
4.5.1酵母的蛋白质分泌运输机制 184
4.5.2酵母的信号肽及其剪切系统 185
4.5.3酵母分泌型蛋白的糖基化修饰 187
4.6利用重组酵母生产乙肝疫苗 189
4.6.1乙肝病毒的结构 189
4.6.2产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母的构建 190
4.6.3产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母的构建 191
4.7利用重组酵母生产人血清清蛋白 192
5高等动物基因工程 197
5.1动物转基因技术的基本概念 197
5.1.1动物转基因的效率 197
5.1.2动物转基因的结构 197
5.1.3动物转基因的表达特性 198
5.1.4动物转基因的生物学效应 199
5.2转基因导入动物体内的方法 199
5.2.1转基因的动物受体细胞系统 199
5.2.2动物细胞物理转化法 201
5.2.3动物病毒转染法 202
5.2.4工程胚胎干细胞法 207
5.2.5体细胞转基因克隆法 209
5.3利用动物转基因技术研究基因的表达与功能 209
5.3.1利用转报告基因探测动物基因组中的调控序列 210
5.3.2利用同源基因灭活细胞内源基因 212
5.3.3利用CreloxP系统条件性敲除基因 213
5.3.4利用CRISPRCas系统条件性敲除基因 214
5.3.5利用反义基因抑制细胞基因表达 215
5.3.6利用干扰RNA阻断特定基因表达 217
5.4利用转基因动物或细胞生产生物大分子 217
5.4.1动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理 217
5.4.2利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产结构复杂的人体蛋白 219
5.4.3利用动物乳腺组织生产蛋白药物 220
5.5转基因技术在动物遗传性状改良中的应用 222
5.5.1转基因鼠 222
5.5.2转基因兔、猪、羊 223
5.5.3转基因牛 224
5.5.4转基因鸡 224
5.5.5转基因鱼 224
5.6基因治疗 225
5.6.1基因治疗的基本战略思想 225
5.6.2肿瘤的基因治疗 227
5.6.3囊性纤维变性症的基因治疗 230
5.6.4杜兴肌营养不良症的基因治疗 231
5.6.5重度联合免疫缺陷症的基因治疗 231
5.6.6糖尿病的基因治疗战略 232
5.6.7骨髓细胞的转基因研究 232
5.6.8基因治疗的副反应及其对策 233
6高等植物基因工程 237
6.1高等植物的遗传学特性 237
6.2高等植物的基因转移系统 238
6.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统 238
6.2.2植物病毒介导的转染系统 243
6.2.3植物细胞的直接转化方法 247
6.2.4植物原生质体的再生 249
6.3高等植物的基因表达系统 249
6.3.1外源基因的四环素诱导系统 250
6.3.2外源基因的乙醇诱导系统 252
6.3.3外源基因的类固醇诱导系统 253
6.3.4外源基因的地塞米松诱导和四环素抑制系统 255
6.4利用植物转基因技术研究基因的表达与调控 255
6.4.1利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱 255
6.4.2利用病毒载体探查植物基因重排 256
6.4.3利用转座元件克隆植物基因 256
6.4.4利用T-DNA构建植物遗传突变株 257
6.5利用转基因植物生产重组异源蛋白和工业原料 257
6.5.1利用植物生物反应器生产医用蛋白 257
6.5.2利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 259
6.5.3利用植物生物反应器生产工业原料 259
6.6转基因技术在植物品种改良中的应用 260
6.6.1控制果实成熟的转基因植物 260
6.6.2抗虫害的转基因植物 261
6.6.3抗病原体的转基因植物 262
6.6.4抗除草剂的转基因植物 263
6.6.5改变花型花色的转基因植物 264
6.6.6抗环境压力的转基因植物 264
6.6.7产生高品质产物的转基因植物 265
6.6.8转基因植物的安全性 266
7第二代基因工程——蛋白质工程 269
7.1蛋白质工程的基本概念 269
7.1.1蛋白质工程的基本特征 269
7.1.2蛋白质工程的研究内容及应用 270
7.1.3蛋白质工程实施的必要条件 271
7.2基因的体外定向突变 271
7.2.1局部随机掺入法 271
7.2.2碱基定点转换法 272
7.2.3部分片段合成法 274
7.2.4引物定点引入法 275
7.2.5 PCR扩增突变法 277
7.3基因的体外定向进化 279
7.3.1易错PCR 279
7.3.2 DNA改组 279
7.3.3体外随机引发重组 281
7.3.4交错延伸 282
7.3.5过渡模板随机嵌合生长 283
7.3.6渐增切割杂合酶生成 284
7.3.7同源序列非依赖性蛋白质重组 285
7.3.8突变文库的筛选模型 285
7.4蛋白质工程的设计思想与应用 287
7.4.1提高蛋白质或酶的稳定性 287
7.4.2减少重组多肽链的错误折叠 290
7.4.3改善酶的催化活性 291
7.4.4消除酶的被抑制特性 293
7.4.5修饰酶的催化特异性 293
7.4.6强化配体与其受体的亲和性 296
7.4.7降低异源蛋白药物的免疫原性 296
8第三代基因工程——途径工程 303
8.1途径工程的基本概念 303
8.1.1途径工程的基本定义 303
8.1.2途径工程的基本过程 304
8.1.3途径工程的基本原理 307
8.2途径工程的研究战略 307
8.2.1在现存途径中提高目标产物的代谢流 308
8.2.2在现存途径中改变物质流的性质 311
8.2.3利用已有途径构建新的代谢旁路 312
8.3初级代谢的途径工程 314
8.3.1乙醇生产菌的途径操作 314
8.3.2辅酶Q生产菌的途径操作 321
8.3.3氢气生产菌的途径操作 328
8.4次级代谢的途径工程 329
8.4.1聚酮生物合成的分子机制 329
8.4.2聚酮合酶各组成模件的操作战略 330
8.4.3聚酮生物合成基因的异源表达 333