第一章 microRNA概述 1
第一节 microRNA的生物起源和生物合成 2
1 microRNA的生物起源 2
2 microRNA的生物合成 2
第二节 microRNA的特征和命名 5
1 microRNA的特征 5
2 microRNA的命名 6
第三节 microRNA的调控机制 7
第四节 microRNA的功能 8
1 miRNA在动物生长发育等方面的功能 9
2 miRNA在植物生长发育等方面的功能 10
第二章 microRNA的鉴定和表达分析策略 15
第一节 microRNA的鉴定 16
1 正向遗传学筛选法 16
2 直接克隆法 16
3 生物信息学预测法 17
4 高通量测序法 19
第二节 microRNA的表达分析策略 21
1 microRNA的芯片分析 21
2 microRNA的PAGE/Northern Blot分析 33
3 microRNA的实时定量RT-PCR检测 35
第三章 microRNA靶基因的分析策略 39
第一节 microRNA候选靶基因的寻找 40
1 microRNA候选靶基因的生物信息学预测 40
2 寻找microRNA候选靶基因的生物学实验方法 52
第二节 microRNA候选靶基因的生物学鉴定 54
1 荧光定量PCR及Western blot法 54
2 双荧光素酶报告基因法 55
3 RLM-5＇RACE法 55
4 降解组测序法 57
第四章 microRNA的生物功能分析策略 59
第一节 microRNA过量表达 60
1 化学合成microRNA模拟物（microRNA mimics） 60
2 构建microRNA过量表达载体 61
第二节 microRNA减低表达 63
1 化学合成microRNA抑制剂（microRNA inhibitor） 63
2 靶基因模拟技术（target mimicry，TM） 63
第三节 人工miRNA（artificial microRNA，amiRNA） 69
第五章 microRNA165/166在植物中的功能研究 71
第一节 植物microRNA165/166研究进展 72
第二节 microRNA165/166在植物中的功能研究所用到的材料与方法 75
1 植物材料和生长条件 75
2 STTM165/166载体的构建及拟南芥和番茄的转化 75
3 RNA提取、Northern blot和实时定量PCR分析 77
4 组织学 79
5 液质联用半定量法测定IAA含量 80
6 花青素含量的测定 80
第三节 STTM165/166过表达植株中miR-165/166及其靶基因的表达分析 80
第四节 STTM165/166转基因拟南芥和番茄的表型特征 82
1 STTM165/166转基因拟南芥幼苗的表型特征 82
2 STTM165/166转基因拟南芥主茎、侧枝、花和果荚表型 82
3 过表达STTM165/166对拟南芥叶片极性和茎维管组织结构的影响 84
4 STTM165/166转基因番茄的表型变化 86
第五节 STTM165/166对生长素生物合成和信号的调控 87
第六节 STTM165/166对植物抗盐能力的影响 91
第七节 STTM165/166对拟南芥花青素生物合成的影响 94
第八节 miR-165/166介导的调控网络 94
第六章 microRNA828调控番茄花青素生物合成的功能研究 97
第一节 植物microRNA828研究进展 98
第二节 microRNA828在番茄中的功能研究所用到材料与方法 100
1 材料 100
2 番茄植株缺磷胁迫处理方法及培育 100
3 DNA和RNA的提取 100
4 miR-828靶基因的预测和RLM-5＇RACE实验验证 101
5 At-pri-miR-828原始转录本序列的获得及引物设计与PCR扩增 101
6 PCR产物的纯化与测序 102
7 克隆载体pOT2-At-pri-miR-828和植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR-828的构建 102
8 农杆菌介导的叶盘法转化番茄 102
9 转基因番茄植株的PCR鉴定 102
10 实时荧光定量qRT-PCR分析 103
11 花青素含量的测定 103
第三节 miR-828基因的克隆、表达及其对番茄的遗传转化 104
1 拟南芥At-pri-miR-828基因的克隆 105
2 番茄Sly-pri-miR-828基因的克隆 105
3 番茄Sly-miR-828的组织特异性表达 105
4 番茄miR-828靶基因的预测及RLM-5＇RACE体外分子剪切鉴定 105
5 miR-828过表达克隆载体、表达载体的构建与鉴定 107
6 农杆菌介导pC2300-pOT2-pri-miR-828对番茄的遗传转化 108
7 转基因番茄植株的PCR鉴定 108
8 转基因番茄植株相关基因表达的实时荧光定量PCR分析 109
9 转基因番茄植株的表型鉴定及花青素测定 110
第四节 缺磷胁迫下miR-828过表达对番茄花青素生物合成的影响 111
1 miR-828对缺磷胁迫的响应 111
2 缺磷胁迫下野生型番茄幼苗的表型特征 112
3 正常MS生长条件下野生型和miR-828过表达转基因番茄的表型特征 112
4 缺磷胁迫下野生型和miR-828过表达转基因番茄植株的表型特征 112
5 缺磷胁迫下野生型和miR-828过表达转基因番茄中miR-828及其靶基因的表达分析 113
6 缺磷胁迫下野生型和miR-828过表达转基因番茄植株中花青素合成相关酶基因的表达分析 114
7 缺磷胁迫下野生型和miR-828过表达转基因番茄植株中的花青素含量 114
第七章 microRNA858调控的花青素生物合成 117
第一节 植物microRNA858研究进展 118
第二节 microRNA858在番茄中的功能研究所用到材料与方法 119
1 植物材料和生长条件 119
2 pC2300-pOT2-STTM858植物表达载体的构建 119
3 RNA提取、cDNA合成及实时定量PCR分析 119
4 miR-858靶基因的预测和RLM-5＇RACE实验验证 122
5 农杆菌介导的叶盘法转化番茄 122
6 转基因番茄植株的PCR鉴定 122
7 花青素含量的测定 122
第三节 miR-858在番茄花青素生物合成中的调控作用 122
1 番茄Sly-miR-858的克隆 122
2 番茄Sly-miR-858的保守性和序列分析 123
3 番茄Sly-miR-858靶基因的预测及RLM-5＇RACE体外分子剪切鉴定 123
4 Sly-miR-858靶基因Sly-myb-like氨基酸的多重序列比对和进化树分析 126
5 Sly-miR-858及其靶基因Sly-myb-like在番茄不同组织中的表达 127
6 Sly-miR-858减低表达载体STTM858的构建与番茄的遗传转化 127
7 转基因番茄植株STTM858、内源miR-858及其靶基因的实时荧光定量PCR分析 127
8 STTM858转基因番茄植株的表型分析及花青素含量测定 129
9 STTM858过表达转基因番茄植株花青素合成相关酶基因的实时荧光定量PCR分析 129
第八章 小麦干旱胁迫诱导基因TaCRT的功能及其对microRNA的表达调控 133
第一节 钙网蛋白CRT研究进展 134
第二节 小麦钙网蛋白TaCRT的功能研究所用到材料与方法 135
1 植物材料和干旱胁迫实验 136
2 TaCRT基因全长cDNA的克隆 136
3 TaCRT的亚细胞定位 137
4 Southem杂交印迹分析 138
5 Northern杂交印迹分析 138
6 半定量PCR 138
7 pCAPE2-TaCRT表达载体的构建及烟草的转化 139
8 Westem Blotting蛋白印迹分析 140
9 TaCRT转基因烟草植株的抗旱性鉴定 140
10 TaCRT转基因烟草植株的microRNA芯片表达谱 141
第三节 TaCRT在干旱胁迫中的功能及其对microRNA的表达调控 141
1 TaCRT的克隆 141
2 TaCRT cDNA序列的结构特征分析 141
3 TaCRT的Southem杂交分析 142
4 TaCRT蛋白的亚细胞定位 143
5 PEG诱导的干旱胁迫下小麦TaCRT基因的表达模式 146
6 TaCRT转基因烟草植株的鉴定 148
7 转基因烟草的抗旱性分析 151
8 小麦干旱胁迫诱导基因TaCRT介导的microRNA表达调控 154
第九章 植物逆境胁迫响应microRNA的研究 157
第一节 植物逆境胁迫响应microRNA研究进展 158
1 miRNA与低氮胁迫 158
2 miRNA与低硫胁迫 158
3 miRNA与低磷胁迫 159
4 miRNA与铜胁迫 160
5 miRNA与重金属胁迫 160
6 miRNA与高盐胁迫 160
7 miRNA与低温胁迫 161
8 miRNA与干旱胁迫 161
9 miRNA与植物病虫害胁迫 162
10 miRNA与氧化胁迫 163
11 miRNA与机械胁迫 163
12 miRNA与UV-B辐射胁迫 164
第二节 植物逆境胁迫响应microRNA研究所用到材料与方法 165
1 植物材料和胁迫条件 165
2 植物miRNA芯片的设计、PAGE/Northem Blot、实时荧光定量qRT-PCR分析 165
3 miRNA基因启动子区的顺式作用元件分析 165
第三节 miR-398在NaCl和ABA胁迫下木本植物杨树和草本植物拟南芥中的差异表达分析 166
1 木本植物杨树在NaCl和ABA胁迫下的microRNAs表达谱分析 166
2 ABA和NaCl胁迫处理动态调控杨树miR-398及其靶基因的表达 169
3 杨树和拟南芥中miR-398及其靶基因对ABA和NaCl胁迫的响应不同 172
第四节 UV-B胁迫下木本植物杨树的microRNAs表达谱分析 174
1 杨树UV-B胁迫响应microRNAs表达谱分析 174
2 UV-B胁迫响应miRNA的PAGE/Northem验证 178
3 UV-B胁迫响应miRNA靶基因的功能分析 179
4 UV-B胁迫响应miRNA靶基因的qRT-PCR分析 180
5 UV-B胁迫响应miRNA基因的启动子元件分析 182
6 UV-B胁迫响应miRNA介导的基因表达调控网络 184
参考文献 187
发表与本专著相关的论文 217