1 猪重要经济性状候选基因研究进展 1
1.1 繁殖性状候选基因研究进展 1
1.1.1 雌激素受体基因 1
1.1.2 卵泡刺激素基因 2
1.1.3 促黄体素基因 3
1.1.4 骨形态发生蛋白基因 3
1.1.5 促性腺激素释放激素及其受体基因 4
1.1.6 促红细胞生成素受体 4
1.1.7 骨桥蛋白基因 5
1.1.8 谷胱甘肽硫转移酶M2亚型基因 6
1.1.9 TGF-β1基因 6
1.1.10 催乳素受体基因 7
1.1.11 视黄醇结合蛋白4基因 7
1.1.12 视黄酸受体基因 8
1.1.13 视黄素X受体基因 8
1.1.14 甲状腺素运载蛋白基因 9
1.2 脂肪性状候选基因研究进展 9
1.2.1 肝细胞核因子-4α基因 9
1.2.2 肝X受体基因 10
1.2.3 Krox20基因 11
1.2.4 脂蛋白脂肪酶基因 11
1.2.5 脂肪酸结合蛋白基因 12
1.2.6 肥胖基因 12
1.2.7 激素敏感脂肪酶基因 13
1.3 肉质性状候选基因研究进展 13
1.3.1 腺苷一磷酸脱氨酶基因 13
1.3.2 腺苷琥珀酸裂解酶基因 14
1.3.3 氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶／次黄嘌呤核苷酸环水解酶基因 15
1.3.4 谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶基因 15
1.3.5 钙蛋白酶基因 16
1.3.6 半胱氨酸蛋白酶抑制剂B基因 16
1.4 肌肉生长性状候选基因研究进展 17
1.4.1 生肌调节因子家族 17
1.4.2 肌细胞增强因子2家族 19
1.4.3 肌肉生长抑制素基因 19
1.4.4 Ⅰ型兰尼定受体基因 20
1.5 抗逆性状候选基因研究进展 20
1.5.1 抗黏液病毒基因 20
1.5.2 天然抗性巨噬蛋白1基因 21
1.5.3 唾液酸合成酶基因 21
1.5.4 Toll样受体家族 22
1.5.5 冷诱导RNA结合蛋白基因 23
1.5.6 Y-box结合蛋白-1基因 23
1.6 体长性状候选基因研究进展 24
1.6.1 多形性腺瘤基因 24
1.6.2 生殖细胞核因子 24
1.6.3 配体依赖的核受体辅阻遏物 25
2 猪基因克隆与序列分析 26
2.1 材料与方法 26
2.1.1 实验动物组织样 26
2.1.2 菌株和克隆载体 26
2.1.3 主要仪器设备 26
2.1.4 主要药品和酶 27
2.1.5 缓冲液及主要溶液的配制 27
2.1.6 DNA的提取与检测 28
2.1.7 组织总RNA的提取与检测 29
2.1.8 引物设计与合成 29
2.1.9 cDNA克隆 35
2.1.10 基因组DNA克隆 39
2.1.11 主要分子生物学软件及统计分析软件 40
2.2 结果与分析 40
2.2.1 HNF-4α基因克隆与序列分析 40
2.2.2 LXRα基因克隆与序列分析 46
2.2.3 RXRα基因克隆与序列分析 51
2.2.4 MEF2A基因克隆及序列分析 58
2.2.5 CstB基因克隆与序列分析 65
2.2.6 RPS3基因克隆与序列分析 68
2.2.7 OPN基因克隆与序列分析 70
2.2.8 EPOR基因克隆与序列分析 74
2.2.9 GnRH及其受体基因克隆与序列分析 76
2.2.10 长白猪ADSL基因克隆与序列分析 77
2.2.11 长白猪PurH基因克隆与序列分析 81
2.2.12 民猪GPAT基因克隆与序列分析 84
2.2.13 民猪MyoG基因克隆与序列分析 87
2.2.14 SRPK1/3基因克隆与序列分析 91
2.2.15 BMP-6基因克隆与序列分析 98
2.2.16 IGFBP7基因克隆与序列分析 106
2.2.17 CIRP基因克隆与序列分析 112
2.2.18 PDZRN3基因克隆与序列分析 114
2.2.19 COX1基因克隆与序列分析 118
2.2.20 NANS基因克隆与序列分析 121
2.2.21 NUMB基因克隆与序列分析 124
2.2.22 IgG重链基因克隆与序列分析 128
2.2.23 IRG6基因克隆与序列分析 132
2.2.24 OAS1基因克隆与序列分析 134
2.2.25 YB1基因克隆与序列分析 137
2.3 讨论 138
2.3.1 关于取样、RNA提取和反转录反应 138
2.3.2 cDNA克隆 139
2.3.3 基因组DNA部分片段克隆 140
3 猪基因表达规律研究 142
3.1 材料与方法 142
3.1.1 实验动物组织样 142
3.1.2 主要仪器设备 142
3.1.3 总RNA的提取与检测 142
3.1.4 引物设计与合成 142
3.1.5 反转录反应 143
3.1.6 线性增长试验 143
3.1.7 PCR扩增 143
3.1.8 琼脂糖凝胶电泳检测 144
3.1.9 竞争性RT-PCR 144
3.1.10 Real-time PCR反应 145
3.1.11 数据分析 145
3.2 结果与分析 145
3.2.1 RBP4基因的时空转录情况 145
3.2.2 RAR基因的时空转录情况 149
3.2.3 RXR基因的时空转录情况 153
3.2.4 TTR基因的时空转录情况 157
3.2.5 HNF-4α基因的转录情况 158
3.2.6 LXRα基因的时空转录情况 159
3.2.7 OPN基因的时空转录情况 161
3.2.8 MEF2基因的转录分析 166
3.2.9 EGR2及其调控相关基因的转录情况检测 171
3.2.10 MC3R基因的转录分析 173
3.2.11 CstB基因的时空转录分析 174
3.2.12 LPL基因的时空转录分析 182
3.2.13 SRPK1/3基因的时空转录分析 187
3.2.14 BMP-6基因的定量检测 189
3.2.15 IGFBP7基因的定量检测 189
3.3 讨论 190
3.3.1 相对定量RT-PCR分析 190
3.3.2 竞争性RT-PCR分析 191
3.3.3 Real-time PCR分析 191
4 猪基因单核苷酸多态性分析 194
4.1 实验方法 194
4.1.1 实验动物组织样 194
4.1.2 药品和酶 194
4.1.3 主要仪器设备 194
4.1.4 基因组DNA的提取与检测 194
4.1.5 引物设计与合成 194
4.1.6 PCR-SSCP检测 200
4.1.7 基因多态性的统计方法 201
4.2 结果与分析 202
4.2.1 EGR2基因的单核苷酸多态性分析 202
4.2.2 HNF-4α基因的单核苷酸多态性分析 203
4.2.3 ADSL基因的单核苷酸多态性分析 206
4.2.4 PurH基因的单核苷酸多态性分析 207
4.2.5 GPAT基因的单核苷酸多态性分析 208
4.2.6 SRPK1/3基因的单核苷酸多态性分析 210
4.2.7 GSTM2基因的单核苷酸多态性分析 212
4.2.8 TGF-β1基因的单核苷酸多态性分析 220
4.2.9 BMP-6基因的单核苷酸多态性分析 223
4.2.10 GnRHR基因的单核苷酸多态性分析 225
4.2.11 TLR4基因的多态性分析 227
4.2.12 PLAG1基因多态性分析 233
4.2.13 NR6A1基因多态性分析 236
4.2.14 LCORL基因多态性分析 240
4.3 讨论 243
4.3.1 基因组DNA提取 243
4.3.2 PCR-SSCP多态性分析 244
5 猪基因功能分析 246
5.1 实验方法 246
5.1.1 缓冲液及主要试剂的配制 246
5.1.2 引物的设计与合成 247
5.1.3 细胞培养 255
5.1.4 RNA干扰 258
5.1.5 过量表达 261
5.1.6 荧光素酶活性测定 261
5.1.7 数据统计分析 262
5.1.8 生物信息学分析 262
5.2 结果与分析 262
5.2.1 Krox20对脂肪细胞的影响 262
5.2.2 Smad3、GDF8和MyoD对猪骨骼肌卫星细胞的影响及互作 274
5.2.3 民猪MyoG基因启动子核心区定位 284
5.2.4 民猪CYP1A1基因启动子核心区定位 288
5.2.5 民猪MC4R基因启动子核心区定位 295
5.2.6 民猪FST基因启动子核心区定位 299
5.3 讨论 303
5.3.1 shRNA的设计与筛选 303
5.3.2 前体脂肪细胞体外培养 303
5.3.3 骨骼肌卫星细胞培养及鉴定 308
5.3.4 转染效率的影响因素 309
5.3.5 Krox20对猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响 309
5.3.6 Smad3、MyoD与GDF-8对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响 311
5.3.7 Smad3、MyoD与GDF-8在骨骼肌卫星细胞增殖过程中的调控网络关系 312
5.3.8 MyoG基因启动子区域生物信息学分析 313
5.3.9 MyoG基因启动子活性分析 314
5.3.10 CYP1A1基因启动子活性分析 315
5.3.11 MC4R基因启动子活性分析 315
6 猪基因组织特异性表达分析 317
6.1 材料与方法 317
6.1.1 载体与菌株 317
6.1.2 MC4R特异表达载体的构建与表达 317
6.1.3 FST基因特异表达载体的构建与表达 319
6.2 结果与分析 321
6.2.1 MC4R基因特异表达载体的构建与表达 321
6.2.2 FST基因特异表达载体的构建与表达 327
6.3 讨论 335
6.3.1 MC4R-P1/P2重组质粒的构建 335
6.3.2 FST-P1、FST-P2重组质粒的构建 335
6.3.3 FST-P3、FST-P4重组质粒的构建 336
6.3.4 Tet-On系统的优点 336
6.3.5 瞬时转染后细胞状态的观察 337
6.3.6 诱导表达基因的检测 337
6.3.7 诱导MC4R基因对CMS系统的影响 338
6.3.8 FST与MyoD、MyoG、MSTN、GDF11之间的互作分析 338
7 高通量测序分析猪差异表达基因 340
7.1 材料与方法 340
7.1.1 实验材料与测序 340
7.1.2 数据整理与分析 340
7.2 结果与分析 342
7.2.1 测序质量评估 342
7.2.2 clean tag拷贝数分布统计 342
7.2.3 clean tag比对统计 342
7.2.4 差异表达基因及部分功能基因的表达 342
7.2.5 反义转录本与新转录本预测结果 343
7.2.6 GO功能显著性富集分析 343
7.2.7 Pathway显著性富集分析 345
7.2.8 测序饱和度分析 345
7.3 讨论 346
7.3.1 高通量测序数据的初步分析 346
7.3.2 部分差显基因或转录子的表达分析 346
7.3.3 GO和Pathway分析 347
参考文献 348
附录 359
附录一 本研究中获得的GenBank登录号 359
附录二 本研究涉及的学位论文 361
附录三 差异倍数在2倍以上的上调差异基因 363
附录四 差异倍数在2倍以上的下调差异基因 368
附录五 彩色插图 459
附录六 本研究涉及的猪种 469
附录七 参编人员 471