1日本七鳃鳗形态解剖学研究 1
1.1引言 1
1.1.1无颌类的形态特征 1
1.1.2无颌类的食性 2
1.1.3无颌类的生活史 3
1.1.4无颌类的分类依据及我国的主要种类 4
1.2日本七鳃鳗的研究价值 6
1.2.1七鳃鳗化石与基因的研究揭示脊椎动物颌形成的机制 7
1.2.2七鳃鳗脑的个体发育重演了脊椎动物脑的系统发育 8
1.2.3七鳃鳗幼鳗的胰岛器官是脊椎动物胰岛器官系统发育的最简单阶段 9
1.2.4小结 10
1.3日本七鳃鳗消化系统形态学研究 10
1.3.1材料和方法 11
1.3.2结果 11
1.3.3讨论 13
1.4日本七鳃鳗消化系统组织学研究 14
1.4.1材料和方法 14
1.4.2结果 16
1.4.3讨论 18
1.5日本七鳃鳗消化系统组织化学研究 19
1.5.1材料和方法 19
1.5.2结果 20
1.5.3讨论 21
1.6日本七鳃鳗消化系统亚显微结构研究 21
1.6.1材料和方法 21
1.6.2结果 22
1.6.3讨论 24
1.7结论 24
2日本七鳃鳗口腔腺表达序列标签分析 26
2.1引言 26
2.1.1EST技术简介 26
2.1.2FST技术的研究方法 27
2.1.3EST的主要应用 32
2.1.4EST研究的局限性 35
2.1.5七鳃鳗EST研究现状 35
2.2日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库的构建 36
2.2.1材料与方法 36
2.2.2结果 40
2.2.3讨论 40
2.3日本七鳃鳗口腔腺表达序列标签的获得与分析 43
2.3.1材料与方法 43
2.3.2结果 44
2.3.3讨论 48
2.4日本七鳃鳗口腔腺分泌物成分与EST序列的比对分析 52
2.4.1材料和方法 52
2.4.2结果 54
2.4.3讨论 54
2.5结论 56
2.5.1完成了cDNA文库的后续处理和序列测定工作 56
2.5.2完成了对所获表达序列标签的同源性比对分析 57
3日本七鳃鳗肝脏表达序列标签分析与比较转录组研究 58
3.1引言 58
3.2日本七鳃鳗肝脏cDNA文库的构建与EST测序 59
3.2.1材料与方法 59
3.2.2 cDNA文库的质量鉴定 60
3.2.3讨论 60
3.3日本七鳃鳗肝脏表达序列表达标签（EST）分析 61
3.3.1方法 61
3.3.2结果与分析 62
3.3.3讨论 68
3.4结论 74
3.4.1完成了cDNA文库的构建和后续序列测定工作 74
3.4.2完成了对所获表达序列标签的生物信息学分析 75
4日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的差异表达 76
4.1引言 76
4.1.1无颌类脊椎动物免疫器官的进化 76
4.1.2无颌类脊椎动物淋巴细胞的进化 76
4.1.3无颌类脊椎动物免疫相关因子的研究 77
4.1.4无颌类脊椎动物适应性免疫机制 79
4.1.5限制片段差异显示聚合酶链反应在基因差异表达方面的研究 80
4.1.6讨论 80
4.2日本七鳃鳗类淋巴细胞的分离、纯化及细胞学特征 81
4.2.1材料与方法 81
4.2.2结果 82
4.3日本七鳃鳗类淋巴细胞的异质性分析 84
4.3.1材料与方法 84
4.3.2结果 85
4.3.3讨论 86
4.4 RFDD-PCR方法分析日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的差异表达 87
4.4.1材料与方法 87
4.4.2结果 93
4.4.3讨论 97
4.5结论 98
4.5.1成功分离和纯化日本七鳃鳗的类淋巴细胞，并确定其单个核细胞层的最佳分离液相对密度为1.092 98
4.5.2从细胞形态和组织化学研究等侧面分析了七鳃鳗类淋巴细胞的异质性 98
4.5.3 RFDD-PCR方法建立日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的表达谱并筛选得到VLR同源基因 98
5脊椎动物激肰原基因的系统发育分析 100
5.1引言 100
5.1.1哺乳动物激肰原基因研究概况 100
5.1.2非哺乳动物激肰原基因研究进展 104
5.1.3小结 104
5.2脊椎动物激肰原基因的系统发育分析 105
5.2.1材料和方法 105
5.2.2结果 106
5.2.3讨论 114
5.2.4小结 116
5.3日本七鳃鳗肝脏组织中激肰原基因的克隆与分析 117
5.3.1材料和方法 118
5.3.2结果 122
5.3.3讨论 125
5.3.4小结 126
5.4结论 126
6日本七鳃鳗口腔腺分泌液纤溶酶活性及其组分的分离鉴定 128
6.1引言 128
6.1.1酶原型嵌合体纤溶酶——Pro-ACLF 128
6.1.2特异识别纤维蛋白型嵌合体纤溶酶 128
6.1.3抗凝血酶型嵌合体纤溶酶 130
6.1.4抗血小板聚集型嵌合体纤溶酶——Fibro1ase嵌合体衍生物 131
6.1.5抗凝血酶和抗血小板聚集型多效嵌合体纤溶酶 131
6.1.6展望 132
6.2日本七鳃鳗口腔腺分泌液纤溶酶及组织溶解活性的研究 132
6.2.1材料和方法 135
6.2.2结果 140
6.3日本七鳃鳗口腔腺分泌液BGSP-1的纤溶酶活性的研究 153
6.3.1材料与方法 153
6.3.2结果 154
6.4讨论 158
6.5结论 160
7三种重组七鳃鳗RGD毒素蛋白对HeLa、HepG2细胞的活性影响 161
7.1引言 161
7.1.1 RGD肰与整合素识别机制研究进展 161
7.1.2有关Fgy400-411序列和Aa572-575（RGDS）序列在整合素介导的细胞黏附方面的研究 163
7.1.3总结 167
7.2重组七鳃鳗RGD毒素蛋白的生物信息学分析 168
7.2.1方法 168
7.2.2结果 168
7.2.3讨论 168
7.3七鳃鳗RGD毒素蛋白rLj-RGD1、rLj-RGD2、rLj-RGD3的表达／纯化与鉴定 169
7.3.1材料与方法 169
7.3.2结果 172
7.3.3讨论 174
7.4 rLj-RGDl、rLj-RGD2、rLj-RGD3的生物学活性 175
7.4.1材料与方法 176
7.4.2结果 179
7.4.3讨论 184
7.4.4结论 185
8日本七鳃鳗口腔腺 Grimin基因的生物学活性研究 186
8.1引言 186
8.1.1 GRIM-19蛋白的基因特点及其在真核生物中的同源性 186
8.1.2 GRIM-19的组织分布、细胞与染色体定位 187
8.1.3 GRIM-19的生物学功能 188
8.2日本七鳃鳗口腔腺新功能基因Grimin的克隆及序列分析 191
8.2.1材料与方法 191
8.2.2结果 192
8.3 Grimin的诱导表达、鉴定与纯化 194
8.3.1材料与方法 194
8.3.2结果 199
8.3.3讨论 201
8.4 Grimin对人白血病细胞HL60及人脐静脉血管内皮细胞ECV304的生物学活性 202
8.4.1材料与方法 202
8.4.2结果 204
8.5脂质体转染法转染人宫颈癌HeLa细胞和肝癌HepG2细胞后细胞凋亡活性的检测 206
8.5.1材料与方法 206
8.5.2结果 209
8.5.3讨论 211
8.6 Grimin多克隆抗血清的制取及效价测定 212
8.6.1材料与方法 212
8.6.2结果 213
8.6.3讨论 213
8.7结论 215
9重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白基因克隆及HRF活性鉴定 216
9.1引言 216
9.1.1 TCTP的空间结构特点 217
9.1.2 TCTP合成的调控 217
9.1.3 TCTP的生物学特性及功能 218
9.1.4非哺乳动物TCTP的研究 220
9.1.5日本七鳃鳗口腔腺分泌TCTP的研究 221
9.2日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的基因克隆 222
9.2.1材料和方法 222
9.2.2结果 224
9.3 TCTP的生物信息学分析 225
9.3.1对TCTP蛋白系统演化关系进行分析 225
9.3.2对rLj-TCTP蛋白的理化性质预测 226
9.3.3对rLj-TCTP蛋白的结构特征预测 227
9.3.4对rLj-TCTP蛋白的三级结构预测 230
9.4重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的诱导表达、鉴定与纯化 231
9.4.1材料与方法 231
9.4.2结果 234
9.4.3讨论 235
9.5兔抗七鳃鳗血清L-250蛋白多克隆抗体的制备与免疫印迹分析 236
9.5.1材料和方法 236
9.5.2结果 238
9.5.3讨论 239
9.6日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的HRF活性 240
9.6.1材料和方法 240
9.6.2结果 241
9.6.3讨论 242
9.7 rLj-TCTP蛋白刺激大鼠腹腔肥大细胞释放组胺 244
9.7.1材料与方法 244
9.7.2结果 246
9.7.3讨论 247
9.8 rLj-TCTP对HUVEC、HeLa细胞增殖及其凋亡的影响 247
9.8.1材料与方法 247
9.8.2结果 250
9.8.3讨论 253
9.9结论 255
10日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白L251的表达纯化及生物学活性鉴定 256
10.1引言 256
10.1.1 CRISP家族蛋白成员及其分布 256
10.1.2 CRISP家族蛋白的结构特点 259
10.1.3 CRISP家族蛋白的功能 260
10.1.4 CRISP的应用展望 262
10.2基因序列进化分析，L251蛋白的表达及纯化 262
10.2.1材料和方法 262
10.2.2结果 266
10.2.3讨论 272
10.3中性粒细胞跨血管内皮细胞迁移 273
10.3.1材料和方法 273
10.3.2实验结果 274
10.3.3讨论 275
10.4跨HUVEC单层细胞膜迁移实验 277
10.4.1材料与方法 277
10.4.2结果 281
10.4.3讨论 284
10.5 L251对中性粒细胞呼吸爆发的抑制 285
10.5.1材料和方法 285
10.5.2结果 287
10.5.3讨论 288
10.6 L251对中性粒细胞表面整合素表达的影响 289
10.6.1材料和方法 289
10.6.2结果 290
10.6.3讨论 292
10.7 MTT法检测L251对T淋巴细胞增殖抑制 293
10.7.1材料和方法 293
10.7.2结果 294
10.7.3讨论 295
10.8细胞周期法检测T淋巴细胞增殖抑制 296
10.8.1材料与方法 296
10.8.2结果 297
10.8.3讨论 299
10.9结论 300
参考文献 302