第一章 丝状真菌基因型特征的鉴定 1
1 概述 1
2 基因组变异的主要特征 1
3 确定研究目的 2
4 用于基因组分析的技术 3
5 假设 8
6 选择最佳策略 9
方案1 链格孢真菌的RAPD分析 11
7 AFLP技术的原理及其应用 13
方案2 丝状真菌的AFLP分析 16
方案3 丝状真菌的cDNA-AFLP 19
8 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 21
方案4 土壤中真菌的DGGE分析 22
9 重要的数据库和互联网资源 24
第二章 丝状真菌核酸的提取与分析 26
1 概述 26
2 基因组DNA的分离 26
方案1 CTAB法提取真菌基因组DNA 27
方案2 氯化苄（benzyl chloride）法提取真菌基因组DNA 28
方案3 丝状真菌总DNA的分离 29
方案4 固体平板上菌小量DNA的块速提取（以稻瘟病菌为例） 31
方案5 真菌小量DNA的快速提取 31
3 丝状真菌RNA的提取 32
4 RNA的操作 32
方案6 Trizol法提取丝状真菌总RNA 33
方案7 丝状真菌总RNA的提取 33
方案8 真菌总RNA的小量提取（Trizol法） 34
第三章 丝状真菌的DNA转化 35
1 概述 35
2 选择性标记和转化载体 35
3 待转化DNA的质量 37
4 DNA的进入 37
5 REMI转化 38
方案1 稻瘟病菌（Magna porthe grisea）原生质体的制备及转化 38
方案2 毛壳菌原生质体的制备 39
6 真菌ATMT转化 40
方案3 感受态农杆菌细胞的制备与转化 40
方案4 利用农杆菌转化真菌 41
7 电击转化 42
方案5 Tapesia yallundae的电击转化 42
8 转化DNA的命运 42
方案6 丝状真菌中的质粒拯救 43
方案7 农杆菌电击转化感受态的制备与转化 45
第四章 丝状真菌的遗传分析 48
1 子囊菌遗传分析 48
方案1 对真菌孢子进行化学诱变 49
方案2 对真菌的孢子进行紫外诱变 50
方案3 营养缺陷型突变体的筛选与鉴定 51
方案4 温度敏感型突变群体的制备 51
方案5 单孢分离 52
方案6 构巢曲霉的八分体分析 53
方案7 通过准性重配确定里连锁群 54
方案8 稻瘟病菌温度敏感型突变体的筛选 55
2 担子菌遗传分析 56
方案9 鬼伞菌在人工培养条件子实体和担孢子的产生 58
方案10 通过CHEF凝胶电泳分离C.cinereus的染色体 62
方案11 C.cinereus的四分体分离 64
方案12 C.cinereus粉孢子的紫外诱变 65
方案13 利用NTG（MNNG）/EMS对担子菌进行诱变 66
方案14 平板印迹 68
附：担子菌研究中的标准培养基 69
第五章 丝状真菌的基因组分析 70
1 概述 70
2 遗传图谱 70
方案1 克隆固定大小的基因组DNA作为RFLP探针 71
方案2 RAPD操作要点 71
3 电泳核型分析 73
方案3 琼脂糖栓中制备完整染色体DNA 73
方案4 琼脂糖栓电泳 73
方案5 钳位均匀电场电泳 74
4 物理图谱 75
方案6 染色体DNA的RecA-AC 75
方案7 准备BAC载体DNA 78
方案8 准备BAC插入DNA 78
方案9 BAC插入DNA大小的选择，恢复和克隆 79
方案10 将文库克隆排列到杂交膜上 80
方案11 收集克隆文库 80
5 筛选文库 81
方案12 Southern杂交分析混合文库和克隆阵列文库 81
6 染色体步移（chromosome walking） 82
方案13 BAC或者黏粒末端RNA探针的合成 82
方案14 根据插入片段末端序列制备的探针 83
7 真菌基因组分析相关数字资源 85
第六章 真菌发育过程的细胞学分析 86
1 概述 86
2 丝状真菌生长的测定 86
方案1 菌丝顶端生长的测定 86
方案2 菌落生长速度的测定 87
方案3 直线生长速率的测定 87
3 丝状真菌孢子的萌发 87
方案4 真菌孢子的萌发测定 87
4 稻瘟病菌细胞生物学分析 87
方案5 稻瘟病菌产孢培养、孢子收集和附着胞诱导培养 88
方案6 稻瘟病菌侵染过程的组织病理学观察 88
方案7 稻瘟病菌孢子、附着胞内脂质体、糖原的观察 88
方案8 细胞自噬现象的观察 89
方案9 酒精氧化酶活性测定 89
方案10 冷冻替代用于电子显微镜观察 90
方案11 细胞核，细胞壁和隔膜的染色 90
第七章 丝状真菌的信号传导 92
1 概述 92
2 蛋白抽提 93
方案1 构巢曲霉（Aspergillus nidulans）蛋白激酶的抽提 93
3 蛋白免疫沉淀反应 94
方案2 NIMA在大肠埃希菌（E.coli）中的表达和His-tag亲和纯化 94
方案3 蛋白质免疫沉淀（IP） 95
4 凝胶阻滞试验（gel-shift assay）检测蛋白的磷酸化状态 95
方案4 NIMA磷酸化状态的凝胶阻滞试验 96
5 蛋白激酶的底物特异性分析 96
方案5 NIMA激酶分析 97
第八章 丝状真菌的细胞生物学技术 98
1 电子显微镜工作原理及其应用 98
2 扫描电子显微镜样品制备的原理与方法 99
3 透射电子显微镜样品制备的原理与方法 101
4 电镜细胞化学技术 104
5 免疫组化技术 117
第九章 丝状真菌的生化研究方法 120
1 概述 120
2 抽提物的准备 120
方案1 菌丝的摇瓶培养 120
方案2 疏水蛋白的分离 120
3 细胞组分的准备 121
方案3 细胞膜的分离 121
方案4 脉孢霉的液泡分离 122
方案5 线粒体的分离 123
方案6 细胞核的分离 123
方案7 细胞核的抽提 124
方案8 微体的分离 125
4 蛋白分析 125
方案9 孢子和菌丝的小量的蛋白质抽提 125
方案10 从固体培养物中分离胞外酶（N.crassa的脂肪酶） 126
方案11 从新鲜菌丝分离细胞内蛋白，适用于蛋白水解敏感蛋白的方法 126
方案12 从新鲜菌丝分离细胞内蛋白 127
方案13 从冻干菌丝分离胞内蛋白 128
方案14 酶学分析的代谢物抽提 128
第十章 真菌研究中的免疫学方法 129
1 概述 129
2 免疫原分子的特性 129
方案1 免疫抗原的准备 131
3 制备多克隆抗血清 132
方案2 用辛酸和硫酸铵沉淀法纯化抗体 133
方案3 用ELISA测定pAb的滴度和检验上清液中的mAb 134
4 制备单克隆抗体 135
方案4 通过B细胞-骨髓瘤细胞融合制取鼠科杂种瘤细胞 136
方案5 荧光免疫检测 138
方案6 限制性稀释法亚克隆 139
方案7 冷冻法长期储存的杂交瘤细胞 140
方案8 应用抗原介导ELISA鉴定Ig类别／亚类 141
5 蛋白质和糖类抗原决定簇的特性 142
方案9 通过化学和酶学修饰确定的抗原决定簇的特性 143
6 其他经常使用的免疫学分析方法 144
方案10 间接DAS-ELISA 144
7 抗体的提供及其商业发展 145
第十一章 丝状真菌的功能基因组分析 146
1 构建稻瘟病菌突变子库 146
2 目标突变技术 146
3 cDNA文库构建及测序分析 147
方案1 构建附着胞cDNA文库的cDNA的合成 147
4 cDNA文库构建及筛选 152
方案2 cDNA文库构建 152
方案3 质粒pTriplEx2的插入片段的验证 155
5 抑制差减杂交技术 156
方案4 稻瘟病菌附着胞SSH差减文库的构建 158
6 丝状真菌细胞自噬及其研究方法 165
方案5 稻瘟病菌中细胞自噬研究方法 171
方案6 稻瘟病菌细胞自噬研究中的其他相关显微观察 172
方案7 双分子荧光互补技术 174
方案8 蛋白质电泳（Tricine-SDS-PAGE）及蛋白质印迹杂交 176
方案9 酵母双杂交系统研究蛋白互作 180
方案10 细胞表达目的蛋白 184
7 真菌中结合PCR（Double-Joint PCR）基因融合片段操作 186
8 真菌RNAi技术的应用 190
第十二章 丝状真菌分子进化与系统发育分析 205
1 概述 205
2 系统发育分析方法 206
方案1 木霉菌的ITS rDNA的PCR扩增 206
方案2 木霉菌的tef 1-α基因的PCR扩增 207
方案3 木霉菌进行RAPD研究 208
方案4 AFLP技术 209
3 构建系统发育树 209
第十三章 丝状真菌群体遗传分析 211
1 纯培养条件下真菌群体遗传分析 211
方案1 Pot2-rep-PCR 211
方案2 MGR586-RFLP 212
2 免培养技术用于环境中真菌群体的遗传结构分析 212
方案3 土壤真菌DNA的直接提取 215
方案4 土壤样品中真菌总DNA的提取 215
第十四章 真菌分子生物信息学常用软件的使用 217
1 概述 217
2 文件格式 217
3 FASTA格式 219
4 Tab（或其他分隔符）分隔的行文件 219
5 BLAST 222
6 Primer Premier 5 226
7 e-PCR 231
8 Clustal 235
9 BioEdit 237
10 Staden Package 239
参考文献 249