项目一 质粒pMD18-T-EGFP的分离、纯化和鉴定 1
一、项目介绍 1
二、学习目标 1
三、项目实施 1
任务一 创建和谐包容性的工作环境 1
任务二 清洗、包扎常用玻璃器皿和耗材 2
任务三 配制并灭菌各种浓度单位的溶液 4
任务四 创建遗传信息流示意图 6
任务五 碱裂解法分离提取质粒pMD18-T-EGFP及浓度测定 6
任务六 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pMD18-T-EGFP 12
任务七 细菌基因组DNA提取及质量检测 15
四、项目思考 16
五、必备知识 17
（一）基因工程的发展简史 17
（二）基因工程实验规范 23
（三）溶液浓度的计算与换算 24
（四）生物学遗传信息流 25
（五）DNA的结构 27
（六）核酸的理化性质 32
（七）乳糖操纵元 33
（八）载体（一） 39
六、拓展知识 40
（一）基因组大小与基因数量 40
（二）基因操作对人类生存环境的影响 44
（三）真核生物DNA的提取 45
（四）真核基因组DNA的制备技术 47
项目二 绿色荧光蛋白基因（egfp）转录产物RNA的提取 52
一、项目介绍 52
二、学习目标 52
三、项目实施 52
任务一 总RNA的提取及含量测定 52
任务二 mRNA的提取与纯化 56
任务三 RNA琼脂糖凝胶电泳 57
任务四 Northern blot 58
四、项目思考 60
五、必备知识 60
（一）RNA操作注意事项 60
（二）RNA的空间结构和功能 61
（三）mRNA的合成与加工 63
六、拓展知识 70
（一）植物病毒的RNA提取 70
（二）动植物组织mRNA提取 71
（三）兔肝RNA的制备 71
（四）人体细胞总RNA和mRNA的提取 73
项目三 体外扩增目的基因——绿色荧光蛋白基因（egfp） 74
一、项目介绍 74
二、学习目标 74
三、项目实施 74
任务一 以DNA为模板扩增绿色荧光蛋白基因（egfp）——PCR 74
任务二 以mRNA为模板反转录扩增绿色荧光蛋白基因——RT-PCR 76
任务三 实时荧光系统通过反转录定量（RT-qPCR）对基因表达进行分析 79
任务四 cDNA文库构建技术（一）——磁珠法提纯mRNA 82
任务五 cDNA文库构建技术（二）——cDNA链的反转合成 84
四、项目思考 86
五、必备知识 86
（一）DNA的生物合成 86
（二）RNA的生物合成 90
（三）DNA聚合酶的类别和性质 92
（四）其他工具酶 94
（五）PCR技术及其在基因克隆中的应用 97
（六）PCR产物的克隆 103
六、拓展知识 105
（一）巢式PCR 105
（二）cDNA文库构建技术 106
项目四 将绿色荧光蛋白基因（egfp）克隆到载体上 111
一、项目介绍 111
二、学习目标 111
三、项目实施 111
任务一 利用内切酶对载体和基因（egfp）进行酶切 111
任务二 酶切片段的脱磷技术 113
任务三 DNA片段的回收技术 114
任务四 基因的重组连接技术 116
任务五 cDNA文库构建技术（三）——cDNA的连接、包装及转染 119
任务六 RACE技术扩增构建全长cDNA文库 120
四、项目思考 124
五、必备知识 124
（一）限制性内切酶分类和催化机制 124
（二）DNA甲基化酶 131
（三）DNA连接酶 133
（四）其他工具酶的催化机制 136
（五）载体（二） 137
六、拓展知识 143
（一）分子标记 143
（二）RFLP技术 148
（三）RAPD技术 148
（四）AFLP技术 149
（五）SSR技术 149
项目五 将含有egfp基因的质粒转化到E.coli中 151
一、项目介绍 151
二、学习目标 151
三、项目实施 151
任务一 准备溶液及器皿 151
任务二 感受态细胞的制备及热激法将质粒转化到E.coli中 152
任务三 感受态细胞的制备及电击法将质粒转化到E.coli中 154
任务四 农杆菌转化植物细胞 155
任务五 磷酸钙转染动物细胞 157
四、项目思考 158
五、必备知识 158
（一）感受态细胞 158
（二）外源基因导入真核细胞的方法 159
（三）目的基因的筛选策略 161
六、拓展知识 163
（一）基因打靶技术 163
（二）从基因到基因组 164
项目六 基因（egfp）及基因产物（EGFP）检测 166
一、项目介绍 166
二、学习目标 166
三、项目实施 166
任务一 酶切重组载体鉴定目的基因 166
任务二 Southern blot 167
任务三 分子杂交 167
任务四 DNA测序鉴定目的基因一致性 170
任务五 ELISA检测表达产物 172
任务六 SDS-PAGE检测蛋白表达 173
任务七 Western杂交 176
任务八 等电聚焦电泳 177
任务九 蛋白产物的定量测定 179
四、项目思考 182
五、必备知识 182
（一）基因表达系统 182
（二）Southern blot 192
（三）分子杂交技术 192
（四）DNA测序 194
（五）报告基因的应用 195
（六）重组体的筛选与检测 197
六、拓展知识 204
（一）基因芯片 204
（二）基因治疗的基本原理和应用前景 208
参考文献 211