1 高细胞密度发酵液中治疗用蛋白质产物的收集：原理和实例&Elisabeth Russell,Alice Wang,and Anurag S.Rathore 1
1.1 引言 1
1.2 原理 4
1.2.1 离心 4
1.2.1.1 固液分离原理 4
1.2.1.2 影响固液分离的因素 8
1.2.1.3 澄清效率 10
1.2.1.4 关键参数的定义 10
1.2.2 过滤 12
1.2.2.1 垂直流过滤 12
1.2.2.2 切向流过滤 18
1.2.2.3 膜污染 21
1.2.2.4 关键参数的定义 22
1.3 实例：毕氏酵母中表达的治疗用蛋白质的收集 23
1.3.1 材料 23
1.3.2 方法 25
1.3.3 结果与讨论 26
1.3.3.1 离心 26
1.3.3.2 深层过滤（方法1A） 29
1.3.3.3 助滤剂辅助过滤（方法1B） 32
1.3.3.4 微滤（方法2） 33
1.4 结论 36
致谢 37
术语 37
参考文献 37
2 从粗液中捕获产品的膨胀床吸附技术&Alan Sonnenfeld and J？rg Th？mmes 41
2.1 引言 41
2.2 基本原理 42
2.2.1 流态化 42
2.2.1.1 实验方法学 42
2.2.1.2 流化床的稳定性 43
2.2.1.3 生物质存在时床的稳定性测定 45
2.2.2 流化床吸附蛋白质的动力学 45
2.2.2.1 液侧传质 45
2.2.2.2 颗粒侧传质 45
2.3 流化床吸附工作曲线图 46
2.3.1 整合液侧和颗粒侧传质 46
2.4 缓冲液消耗量 46
2.4.1 密度置换 47
2.5 设备改进 47
2.5.1 传统平板分布系统 47
2.5.2 替代分布系统 48
2.6 案例研究 48
2.6.1 工艺开发方法学 48
2.6.1.1 流态化 49
2.6.1.2 床的稳定性 49
2.6.1.3 建模期 49
2.6.1.4 小试 49
2.6.2 分步举例说明（蛋白A亲和EBA纯化抗体） 50
2.6.2.1 流态化 50
2.6.2.2 生物质传输 51
2.6.2.3 膨胀床的稳定性 51
2.6.2.4 吸附动力学 52
2.7 结论和展望 54
参考文献 55
3 高梯度磁钓技术在产品回收中的应用&Matthias Franzreb,Niklas Ebner,Martin Siemann-Herzberg,Timothy J.Hobley,and Owen R.T.Thomas 56
3.1 基本概念 56
3.1.1 使用无孔磁力吸附剂进行分批吸附 56
3.1.2 实例Ⅰ：磁力吸附剂产品结合行为的简单表征 57
3.1.3 高梯度磁力分离（HGMS） 58
3.1.4 高梯度磁钓技术（HGMF） 59
3.1.5 HGMF过程设计 62
3.2 适合于HGMF的吸附剂及其使用条件 63
3.2.1 磁力载体 63
3.2.2 配体的选择 66
3.2.3 实例Ⅱ：采用小规模分批实验测定HGMF吸附剂的使用条件 67
3.3 磁力分离系统的设计与建立 68
3.4 影响系统性能的参数 71
3.4.1 概述 71
3.4.2 简化吸附率估算 71
3.4.3 多组分系统 72
3.4.4 实例Ⅲ：容量比的优化 74
3.4.5 过程产率 76
3.4.6 实例Ⅳ：清洗和洗脱步骤的影响 78
3.4.7 吸附剂的重复利用 78
3.4.8 实例Ⅴ：中试设备的效率 80
3.5 总结 81
参考文献 81
4 蛋白质复性及其放大&Cynthia Cowgill,Asuman G.Ozturk,and Richard St.John 84
4.1 引言 84
4.2 复性基础 84
4.2.1 增溶 85
4.2.2 复性 85
4.2.3 二硫键 86
4.2.4 复性添加剂 86
4.3 复性过程设计 87
4.3.1 决定是否复性 88
4.3.2 有无纯化的蛋白质？ 88
4.3.3 目标蛋白质是否含有二硫键？ 89
4.3.3.1 无二硫键蛋白质的复性 89
4.3.3.2 含二硫键蛋白质的复性 89
4.3.4 复性的分析 90
4.3.5 复性结果和提高复性产率的策略 90
4.3.5.1 不溶性产物 90
4.3.5.2 可溶性产物 91
4.3.5.3 实验设计的应用 91
4.3.6 预制的试剂盒 91
4.3.7 其他复性方法 91
4.3.7.1 分级稀释 92
4.3.7.2 渗滤 92
4.3.7.3 固相复性 92
4.4 复性反应的工艺放大 92
4.4.1 复性反应的组成部分 93
4.4.1.1 导致蛋白质微观不均一性的因素 93
4.4.1.2 组分及对环境健康和安全的关注 95
4.4.1.3 盐酸胍和处理设备 95
4.4.1.4 原材料的商业供应和费用 95
4.4.2 组分的添加和混合 95
4.4.3 二硫键和氧传递 96
4.4.4 混合与罐的类型 101
4.4.5 总结 103
4.5 新兴的复性技术 103
4.5.1 高压复性 103
4.5.1.1 高压复性的机制 104
4.5.1.2 高压复性的放大 104
参考文献 104
5 蛋白质批量结晶——原理与方法&Mark R.Etzel 108
5.1 引言 108
5.2 蛋白质结晶的原理 108
5.3 蛋白质结晶过程开发中需考虑的实际问题 110
5.3.1 数据分析方法1 113
5.3.2 数据分析方法2 113
5.4 应用 116
5.4.1 核酮糖-1,5-二磷酸羧化／加氧酶 116
5.4.2 枯草杆菌蛋白酶 117
5.4.3 抑肽酶 117
5.4.4 胰岛素 117
5.5 前景 119
参考文献 119
6 制备色谱技术&Abhinav A.Shukla and Yinges Yigzaw 122
6.1 引言 122
6.2 色谱的线性保留与非线性保留 122
6.3 亲和色谱 123
6.3.1 蛋白A亲和色谱及其他基团特异性天然配基 124
6.3.2 染料配基亲和色谱 124
6.3.3 免疫亲和色谱 125
6.3.4 仿生配基 125
6.3.5 肽配基 125
6.3.6 亲和标记配基 126
6.4 非亲和色谱 126
6.4.1 离子交换色谱 127
6.4.1.1 离子交换色谱建模 127
6.4.1.2 离子交换树脂 128
6.4.1.3 加样量和结合容量 130
6.4.1.4 离子交换色谱的缓冲液 131
6.4.1.5 清洗、洗脱用盐的选择 131
6.4.1.6 离子交换色谱用于清除杂质 132
6.4.1.7 离子交换色谱过程开发的方法学 132
6.4.2 疏水作用色谱 133
6.4.2.1 疏水作用色谱的理化基础 134
6.4.2.2 疏水作用色谱树脂 135
6.4.2.3 加样条件的选择 136
6.4.2.4 清洗条件的开发 137
6.4.2.5 洗脱条件的选择 138
6.4.2.6 过程开发方法学 138
6.4.3 反相色谱 140
6.4.4 羟磷灰石色谱 141
6.4.5 固定化金属离子亲和色谱 143
6.4.5.1 IMAC树脂与金属离子 143
6.4.5.2 IMAC缓冲液 145
6.4.5.3 IMAC相互作用建模 146
6.4.5.4 IMAC过程开发 146
6.4.6 其他技术 147
6.4.6.1 嗜硫色谱 147
6.4.6.2 疏水性电荷诱导色谱 147
6.4.6.3 混合态离子交换剂与硅胶 148
6.4.6.4 分子排阻色谱 148
6.5 结论 148
参考文献 149
7 色谱固定相的筛选&Abhinav A.Shuka and Xuejun Sean Han 154
7.1 引言 154
7.2 树脂筛选 154
7.2.1 树脂的选择 154
7.2.2 高通量筛选技术 158
7.2.3 选择树脂时其他注意事项 159
7.3 个案研究：Fc融合蛋白的阳离子交换纯化步骤的开发 160
7.3.1 步骤1——确定待筛选树脂 160
7.3.2 步骤2——分批容量测定 161
7.3.3 步骤3——结合亲和力测定 161
7.3.4 步骤4——峰裂分筛选 162
7.3.5 步骤5——清除高分子聚集物的选择性 163
7.3.6 步骤6——去除溶出蛋白A和宿主细胞蛋白质的选择性 163
7.4 结论 165
参考文献 165
8 从蛋白质结构数据预测色谱分离&Asif Ladiwala,Curt M.Breneman,and Steven M.Cramer 166
8.1 引言 166
8.2 量化的结构-性质关系 166
8.3 QSPR建模基本原理 167
8.3.1 分子描述符 167
8.3.2 特征选择 168
8.3.3 建模技术 168
8.4 蛋白质描述符的生成 169
8.4.1 MOE描述符 169
8.4.2 TAE/RECON描述符 170
8.5 SVM建模算法 170
8.6 为从蛋白质结构数据预测柱色谱性能而进行多尺度建模：个案研究 172
8.6.1 空间质量作用形式 173
8.6.2 色谱转运模型 173
8.6.3 蛋白质数据集 174
8.6.4 QSPR模型的生成 175
8.6.5 多尺度模型 175
8.6.6 个案研究总结 177
8.7 QSPR作为生物工艺开发工具 177
8.8 QSPR建模技术的进展和未来方向 179
8.8.1 物理可解释描述符 179
8.8.2 从一级序列信息获得的QSPR模型 180
8.9 结论 181
致谢 181
参考文献 181
9 膜色谱：穿透曲线和病毒清除率分析&Mark R.Etzel and William T.Riordan 187
9.1 引言 187
9.2 膜色谱原理 187
9.2.1 吸附动力学 188
9.2.2 质量传递 189
9.2.3 流动系统中的混合 190
9.3 实验设计与数据分析 190
9.3.1 实验步骤 190
9.3.2 流动系统中的混合 191
9.3.3 质量传递 192
9.3.4 吸附动力学及穿透曲线 192
9.3.5 规模缩小与放大 194
9.4 利用膜色谱清除病毒 194
9.4.1 病毒清除应用中模型的改进 194
9.4.1.1 不可逆吸附 195
9.4.1.2 线性吸附 195
9.4.2 模型在设计中的应用 196
9.4.3 与文献的比较 197
9.5 结论 199
参考文献 200
10 超滤过程设计与实施&Herb Lutz and Bala Raghunath 201
10.1 超滤过程要求 201
10.2 超滤技术基本原理 202
10.2.1 表面极化 203
10.2.2 筛分与截留 204
10.2.3 通量 204
10.2.4 操作 205
10.3 商业化产品 208
10.3.1 超滤膜 208
10.3.2 超滤组件 209
10.4 早期临床阶段过程的开发 211
10.4.1 目标与方法 211
10.4.2 数据分析 212
10.5 放大 215
10.5.1 规模调整 215
10.5.2 操作规程 218
10.5.3 系统要求 219
10.6 硬件 220
10.6.1 设备选型 220
10.6.2 机组布局 222
10.7 超滤过程验证与调试 223
10.8 故障排除 224
10.9 发展前沿 224
参考文献 225
11 病毒过滤过程设计与实施&Michael W.Phillips,Glen Bolton,Mani Krishnan,John J. Lewnard,and Bala Raghunath 227
11.1 背景 227
11.2 病毒过滤器的选择 228
11.3 过程设计与优化 229
11.3.1 垂直流操作 230
11.3.1.1 垂直流病毒过滤器 231
11.3.1.2 垂直流过滤测试设备与规程 231
11.3.1.3 垂直流过滤过程优化 233
11.3.2 切向流操作 237
11.3.2.1 切向流病毒过滤器 237
11.3.2.2 切向流过滤测试设备与规程 237
11.3.2.3 切向流过滤过程优化 239
11.4 过程模拟与放大 240
11.4.1 垂直流过滤 240
11.4.2 切向流过滤 241
11.5 病毒验证研究 242
11.6 过程实施 243
11.6.1 硬件要求（设备要求） 243
11.6.2 操作流程 243
11.6.2.1 过滤器安装 244
11.6.2.2 过滤器冲洗 244
11.6.2.3 标准化水渗透性的测量 244
11.6.2.4 消毒／灭菌 244
11.6.2.5 使用前后的完整性测试 245
11.6.2.6 蛋白质加工与产品回收 248
参考文献 248
12 转基因来源的产品回收&Chenming(Mike)Zhiang and Kevin E.Van Cott 250
12.1 引言 250
12.2 转基因叶类作物中重组蛋白质的初步回收和分离 253
12.2.1 用于转基因烟草中蛋白质分离的ATPE 253
12.2.1.1 背景和实际考虑 253
12.2.1.2 转基因烟草中蛋白质回收的最佳ATPE系统开发的实验方案 255
12.2.2 聚合电解质沉淀法纯化转基因烟草中的蛋白质 259
12.2.2.1 背景和实际考虑 259
12.2.2.2 利用PAA从烟草提取液中沉淀溶菌酶的实验方案 260
12.3 转基因动物乳液中重组蛋白质的纯化 261
12.4 结论 263
参考文献 263
13 生物药物开发中的分析策略&Drew N.Kelnerand Mahesh K.Bhalgat 269
13.1 引言 269
13.2 法规性指南 269
13.3 概述 270
13.4 制定规范 272
13.5 分析检验策略 273
13.6 质量属性 273
13.6.1 效价 273
13.6.2 数量 276
13.6.3 产品鉴别 276
13.6.4 产品纯度 277
13.7 工艺相关杂质 278
13.7.1 宿主细胞蛋白质 278
13.7.2 宿主细胞DNA 279
13.7.3 其他杂质 279
13.8 产品相关杂质 280
13.9 分子量／粒度分布 280
13.10 电荷变体 281
13.11 氧化和断裂形式 281
13.12 安全性测试 282
13.13 产品表征 282
13.14 生物物理学分析 282
13.15 过程分析技术 283
13.16 生物药物的分析检验 283
参考文献 284
14 纯化工艺中病毒清除的评价&Amitava Kundu and Karl Reindel 286
14.1 引言 286
14.2 病毒污染导致的健康风险 287
14.3 病毒清除研究的理论基础和行动计划 287
14.4 病毒清除研究中所用病毒的选择 288
14.5 病毒清除研究对需要评价的步骤的选择 290
14.6 生产工艺步骤的按比例缩小 291
14.7 病毒滴度的估算 292
14.8 细胞毒性和病毒干扰试验 293
14.9 病毒添加研究的设计 293
14.10 病毒清除研究中对数减少因子的计算 295
14.11 药物终产品的安全系数的评估 296
14.12 用于病毒定量分析的定量聚合物酶链式反应 296
14.13 最坏状态的识别 297
14.14 色谱柱的消毒和树脂的重复使用 298
14.15 病毒清除研究的局限性 299
14.16 病毒清除的再评价 299
14.17 病毒清除研究的分类通用方法 299
14.18 病毒清除研究的多病毒添加方法 300
14.19 采用膜吸附剂的病毒清除 301
14.20 结语 302
附录：采用泊松分布测定病毒滴度 302
参考文献 303
15 病毒清除技术进展&Kurt Brorson 306
15.1 引言 306
15.1.1 关键路径计划 306
15.1.2 关键与非关键操作参数 307
15.1.3 稳健性概念 307
15.1.4 简化方法 308
15.1.5 病毒添加物质量 308
15.2 病毒过滤 309
15.2.1 过滤器分类 309
15.2.2 过滤器分级 309
15.3 物理化学灭活 310
15.3.1 溶剂／去污剂处理 310
15.3.2 低pH灭活 310
15.3.3 热处理 311
15.4 色谱 311
15.4.1 蛋白A 311
15.4.2 离子交换色谱 311
15.4.3 介质寿命 312
15.5 新型清除／灭活技术 312
15.6 新型病毒检测方法——Q-PCR 313
致谢 313
参考文献 313
16 蛋白A亲和色谱技术捕获、纯化单克隆抗体和Fc-融合蛋白：对工艺开发的实际考虑&Sanchayita Ghose,Thomas McNerney,and Brian Hubbard 316
16.1 引言 316
16.2 单克隆抗体和Fc-融合蛋白 316
16.3 单克隆抗体和Fc-融合蛋白的纯化 318
16.4 蛋白A亲和色谱 319
16.4.1 蛋白A亲和色谱的固定相 321
16.4.2 工业化工艺中开发蛋白A色谱步骤的实际考虑 323
16.4.2.1 结合容量和工艺产率 323
16.4.2.2 洗脱条件 326
16.4.2.3 清洗除杂质 326
16.4.2.4 蛋白A溶出 327
16.4.2.5 树脂的使用寿命 327
16.4.3 工艺流程图 328
16.5 结论 328
参考文献 329
17 单克隆IgG的精细纯化方法&Pete Gagnon 334
17.1 引言 334
17.2 阴离子交换色谱 334
17.3 阳离子交换色谱 335
17.4 疏水作用色谱 336
17.5 陶瓷羟磷灰石 338
17.6 整体纯化方案 339
17.7 病毒灭活和过滤 342
17.8 未来趋势 343
17.9 结论 344
参考文献 344
18 开发和商业化生产中生物药物生产工艺的变更：REMICADE？的历史&Peter W.Wojciechowski,Hendrik I.Smit,Michele M.Myers,Paul J.Voronko,Timothy Laverty,R.Andrew Ramelmeier,and Richard C.Siegel 346
18.1 引言 346
18.2 Infliximab的结构、功能和制剂 346
18.3 Infliximab生产工艺概述 347
18.4 开发中的工艺变更和产品可比性 348
18.5 商业化生产中的工艺变更和产品可比性 351
18.5.1 放大和批准后变更 353
18.6 支持工艺变更的申报策略 355
19 高黏度流超滤过程的线性放大&Christopher Daniels,Mark Perreault,Brian Gierl,P.K.Yegneswaran,Marshall G.Gayton,David Serway,Ann L.Lee,John Rozembersky,and Narahari S.Puiar 357
19.1 引言 357
19.2 多糖过程流的超滤及线性放大 357
19.3 材料和方法 360
19.4 结果和讨论 361
19.4.1 系统硬件差别对压力的贡献 362
19.4.2 膜盒的结构对压力的贡献 364
19.5 结论 366
附录：转矩和压力转换为夹紧力 366
致谢 367
参考文献 367
20 膜色谱的应用：一种快速、大容量的基因治疗载体纯化工具&Ajay R.Lajmi,Robert Kutner,and Jakob Reiser 369
20.1 引言 369
20.1.1 腺病毒载体 369
20.1.2 基于腺相关病毒的载体 369
20.1.3 慢病毒载体 370
20.1.4 质粒DNA 370
20.2 载体纯化的最新进展 370
20.2.1 腺病毒载体的纯化 370
20.2.2 腺相关病毒载体的纯化 371
20.2.3 慢病毒载体的纯化 372
20.2.4 质粒DNA的纯化 372
20.3 膜色谱技术 374
20.4 使用阴离子交换膜色谱捕获腺病毒载体 374
20.5 使用离子交换膜色谱纯化腺相关病毒载体 377
20.6 使用阴离子交换膜色谱捕获慢病毒载体 378
20.7 使用膜色谱纯化病毒载体的总体优化策略 378
20.7.1 病毒载体的捕获 378
20.7.2 动态结合容量 379
20.8 下游工程和应用阴离子交换膜色谱捕获质粒DNA 379
20.9 小结 380
缩写词表 380
参考文献 381
索引 386