目录 1
绪论 1
第一部分 植物基因资源的开发 7
第一章 植物RNA的分离和纯化 7
第一节 植物RNA分离纯化的一般性原则 7
第二节 几种代表性植物RNA分离纯化程序 9
一、拟南芥RNA的分离纯化 9
二、烟草RNA的快捷分离纯化 10
三、水稻组织RNA的分离纯化 11
四、禾谷类种子中RNA的分离纯化 13
五、林木类被子植物和裸子植物RNA的分离纯化 14
参考文献 16
第二章 cDNA文库的构建 18
第一节 一般cDNA文库构建 18
一、一般cDNA文库构建方法 18
二、注意要点 23
一、CloneMinerTM cDNA文库构建模式 24
第二节 cDNA文库构建的新技术 24
二、CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建模式 26
第三节 均一化cDNA文库和差减cDNA文库的构建 28
第四节 cDNA文库的均一化与消减化的实验操作程序 29
一、仪器 29
二、材料试剂 29
三、注意事项 30
四、步骤 30
参考文献 35
第一节 概述 36
第三章 生物芯片技术——长寡核苷酸片段芯片法 36
第二节 长寡核苷酸型芯片实验 37
一、实验所需主要材料、设备 37
二、实验步骤 37
参考文献 40
第四章 RNA干扰技术 41
第一节 植物稳定转化载体的设计策略 41
一、靶基因RNA内部发夹状反向重复载体 42
二、异源3′-末端非编码区诱发的靶基因的沉默 42
一、农杆菌介导的瞬时表达系统 44
第二节 植物瞬时表达载体的设计策略 44
二、病毒诱导的基因沉默系统 45
三、基因枪介导的瞬时表达系统 46
第三节 植物RNA干扰的生化分析 46
一、材料 47
二、方法 50
三、注释 58
参考文献 58
一、酸性条件提取方法 60
第一节 一般目的基因组DNA的分离纯化 60
第五章 基因组DNA的分离纯化技术 60
二、CTAB提取法 61
三、PVP提取法 62
四、CTAB裂解的阴离子交换树脂法 63
五、SDS裂解的阴离子交换树脂法 64
六、尿素提取法 64
七、其他方法 65
第二节 高分子量基因组DNA的分离纯化 65
二、提取步骤 66
一、所需试剂 66
三、高分子量DNA的电泳检查：脉冲电泳 67
参考文献 67
第六章 基因组DNA文库的构建技术 68
第一节 基因组DNA文库的克隆系统 68
一、细菌-质粒克隆系统 68
二、YAC克隆系统 71
三、P1噬菌体克隆系统 71
一、百万碱基级核DNA制备 72
第二节 细菌大片段基因组DNA文库的构建 72
二、载体的制备 73
三、文库构建 76
第三节 基因组物理作图 80
一、重复杂交法 80
二、荧光原位杂交法 81
三、光学作图法 81
四、染色体步移法 82
五、以DNA标记为基础的染色体着陆法 82
六、测序法 83
八、HAPPY作图法 84
七、放射杂交体作图 84
九、DNA指纹图谱法 85
参考文献 86
第七章 基因遗传定位技术——分子标记及其应用 91
第一节 分子标记类型 91
一、限制性片段长度多态性 91
二、随机扩增多态性DNA 92
三、简单序列重复 92
六、序列标签位点 93
七、序列特异性扩增区 93
四、DNA扩增指纹 93
五、任意引物PCR 93
八、割裂扩增多态性序列 94
九、单引物扩增反应 94
十、扩增片段长度多态性 94
十一、单特征多态性 94
十二、单核苷酸多态性 94
一、基因组作图 95
第二节 分子标记在植物研究中的应用 95
二、基因定位 96
三、基因克隆 97
四、在遗传多样性和进化研究上的应用 97
第三节 遗传作图上广泛使用的分子标记实验技术 98
一、RFLP 98
二、随机扩增多态DNA 101
三、SSR分子标记 102
四、AFLP 109
五、REMAP和IRAP 119
六、SRAP 120
七、SNP 121
参考文献 122
第八章 植物基因启动子的PCR克隆技术 127
第一节 概况 127
第二节 植物启动子克隆的几种PCR方法 128
一、启动子克隆的反向PCR方法 128
二、启动子克隆的TAIL-PCR方法 133
三、接头连接介导的PCR散步法 137
参考文献 141
第九章 植物蛋白的双向凝胶电泳分离和指纹质谱分析 143
一、基本原理 144
二、材料 144
第一节 植物蛋白质双向凝胶电泳分离 144
三、方法 146
第二节 双向凝胶蛋白质点的切取、胶内酶解和多肽片段的纯化 150
一、基本原理 150
二、材料 151
三、方法 151
二、材料 153
第三节 蛋白质指纹质谱分析 153
一、基本原理 153
三、方法 154
第四节 总结与讨论 159
参考文献 160
第十章 酵母双杂交系统 161
第一节 概况 161
第二节 酵母双杂交系统的研究方法 163
一、基本材料 163
二、基本设备 164
三、构建“目标基因”载体 165
四、酵母转化 167
五、检测“目标基因”在酵母中表达 167
六、构建“捕获”cDNA文库 170
七、酵母双杂交筛选相互作用蛋白 171
八、总结 173
参考文献 173
二、根癌农杆菌介导的基因转化及分子机理 177
一、根癌农杆菌的生物学特性 177
第一节 根癌农杆菌介导的转化技术发展与现状 177
第十一章 根癌农杆菌介导的转化技术 177
第二部分 植物基因的转化 177
三、根癌农杆菌在植物基因工程中的应用 178
第二节 根癌农杆菌介导的基因转化方法 180
一、根癌农杆菌的操作 180
二、根癌农杆菌渗透转化拟南芥的方法 184
三、根癌农杆菌转化烟草的方法 185
四、根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化系统 187
五、根癌农杆菌介导的玉米转化 190
六、根癌农杆菌介导的针叶树转化 192
参考文献 195
第十二章 发根农杆菌介导的植物转化 202
第一节 发根农杆菌转化系统——技术与应用状况 202
一、双元载体的转化系统 202
二、多自动转化载体系统 203
三、从发状根再生植株 204
四、发状根系在液体培养基中扩增 204
五、影响发根农杆菌转化效率的因素 205
六、结论 206
第二节 拟南芥转化发状根的产生、维持与转化植株再生 207
一、仪器设备 207
二、试剂及培养基 207
三、实验程序 207
参考文献 208
第十三章 以基因枪为工具的转化技术 213
第一节 微粒轰击法的原理方法及其对植物科学及生物技术的影响 213
一、微粒轰击技术的发展 213
二、微粒轰击技术的应用 215
三、影响微粒轰击过程的主要生物及物理因素 216
四、微粒轰击产生的转基因整合及表达 218
五、微粒轰击法实际应用中轰击能力的开发 220
六、微粒轰击与农杆菌介导的基因转移 221
七、结论 222
第二节 微粒轰击介导的小麦转化方法 222
一、设备与仪器 222
二、材料和试剂 222
三、实验程序 223
参考文献 225
第十四章 以原生质体为基础的转化技术 231
第一节 利用gus报告基因及小麦原生质体瞬时表达系统分析启动子功能 232
一、设备与仪器 233
二、试剂、培养基及组织培养用品 233
三、小麦悬浮细胞培养物的制备与维持 234
四、实验程序 234
第二节 原生质体化学融合技术 235
一、仪器设备 235
二、试剂 235
二、试剂 236
一、仪器设备 236
三、实验程序 236
四、注意事项 236
第三节 原生质体电融合技术 236
三、实验程序 237
四、注意事项 237
参考文献 237
第十五章 叶绿体和其他植物转化技术 239
第一节 叶绿体基因转化技术 239
一、叶绿体基因组及起源 239
二、叶绿体基因转化的历史及现状 239
三、叶绿体转化载体的构建 240
四、叶绿体转化的应用 241
第二节 其他植物转化方法 241
一、显微注射 242
二、胚电泳 242
五、脂质体介导的转化 243
六、硅碳化合物纤维介导的转化 243
三、细胞和组织的电激 243
四、花粉管通道介导的转化 243
七、结论 244
第三节 硅碳化合物纤维WHISKERS介导的玉米转化实验 244
一、仪器设备 245
二、试剂 245
三、实验步骤 245
参考文献 246
第一节 聚合酶链反应 253
一、PCR技术简史 253
第十六章 目的基因整合的分析 253
第三部分 转基因植物的分析和应用 253
二、PCR技术的原理 254
三、PCR反应系统的组成 255
四、PCR反应参数 258
五、标准PCR扩增反应程序 259
六、PCR反应特点 259
第二节 Southern杂交 260
一、放射性同位素标记法 260
二、非放射性地高辛标记DNA探针法 271
参考文献 275
第一节 原位杂交技术的原理与应用 276
一、原位杂交技术提供外源基因在染色体上的直接证据 276
二、原位杂交技术对基因转化规律的分析 276
第十七章 原位杂交技术对染色体上外源基因的定位及结构分析 276
三、原位杂交技术对外源基因插入位点的结构分析 277
四、原位杂交技术在转基因分析中的限制因素 278
一、根尖染色体的制作（滴片法） 279
二、荧光探针的标记（缺口转移法） 279
第二节 转基因玉米中外源DNA的FISH检测实验 279
三、原位杂交及信号观察 280
参考文献 280
第十八章 目的基因的转录分析 282
第一节 Northern杂交 282
一、历史沿革和实践意义 282
二、方法原理 282
三、仪器和试剂 283
四、实验过程 283
一、历史沿革和实践意义 284
第二节 反转录-聚合酶链反应 284
五、结果讨论 284
二、方法原理 285
三、仪器和试剂 285
四、实验过程 285
五、结果讨论 285
第三节 RNA保护反应 286
一、历史沿革和实践意义 286
二、方法原理 286
四、实验过程 287
三、仪器和试剂 287
五、结果讨论 288
第四节 RNA原位杂交 288
一、历史沿革和实践意义 288
二、方法原理 289
三、仪器和试剂 289
四、实验过程 289
五、结果讨论 290
参考文献 291
一、植物蛋白质的SDS提取方法 292
第十九章 目的基因蛋白质表达产物的分析 292
第一节 Western blot分析 292
二、植物蛋白质浓度测定的Bradford方法 293
三、植物蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析 294
四、植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶的染色方法 297
五、SDS-聚丙烯酰胺蛋白质凝胶的Western blot转移方法 299
六、运用碱性磷酸酶偶联第二抗体检测Western膜上的目的蛋白 300
七、运用辣根过氧化物酶偶联第二抗体的化学显色法测定Western膜上的目的蛋白 301
八、运用辣根过氧化物酶偶联第二抗体和增强的化学发光法检测Western膜上的目的蛋白 302
第二节 目的蛋白的组织免疫学定位分析 303
一、植物组织切片的免疫金粒标记技术 304
二、用荧光偶联的第二抗体检测目的蛋白 305
三、植物组织切片的免疫过氧化物酶标记 308
第三节 免疫PCR技术检测转基因植物中的蛋白表达 308
一、免疫PCR体系的组成、试剂与操作步骤 308
二、注意事项 310
参考文献 311
第一节 β-葡萄糖苷酶基因 312
一、组织化学法测定GUS活性 312
第二十章 报告基因的检测分析 312
二、荧光法测定GUS活性 313
三、gus基因的应用 314
第二节 绿色荧光蛋白基因 314
第三节 荧光素酶基因 316
一、luc基因的检测原理及步骤 316
二、luc基因的应用 317
第四节 新霉素磷酸转移酶基因 317
二、检测步骤 318
一、npt-Ⅱ基因的检测原理 318
第五节 氯霉素乙酰转移酶基因 319
一、cat基因的检测原理及步骤 319
二、说明 322
三、cat基因的应用 322
第六节 其他的报告基因 322
一、抗除草剂基因 322
二、β-半乳糖苷酶基因 323
三、潮霉素磷酸转移酶基因 324
参考文献 324