摘要 1
目录 1
1 前言 1
1.1 研究背景 1
英文摘要 3
1.2 研究意义与目前研究状况 3
1.3 研究内容 4
1.4 研究总体思路 5
1.4.1 基本理论 5
缩略词 6
1.4.2 细胞培养实验流程 6
1.4.3 动物实验流程 6
2 低氧调节培养人脐静脉内皮细胞HIF-1与VEGF、Flt-1 DNA结合活性的研究 7
2.1 材料与方法 8
2.1.1 实验仪器 8
2.1.2 主要实验试剂及配制 9
2.1.2.1 主要实验试剂 9
2.1.2.2 主要实验试剂的配制 10
2.1.4.1 核蛋白抽提 11
2.1.3.2 低氧处理 11
2.1.4 实验方法 11
2.1.3.1 人脐静脉内皮细胞培养 11
2.1.3 细胞的培养及低氧处理 11
2.1.4.2 凝胶迁移率变动实验 12
2.1.4.3 转膜 13
2.1.4.4 检测 13
2.1.4.5 凝胶迁移率变动实验结果的凝胶图像分析 14
2.2 研究结果 14
2.2.1 不同低氧条件下培养液中氧分压检测结果 14
2.2.2 HIF-1蛋白与VEGF增强子序列的EMSA实验观察结果 14
2.2.4 HIF-1蛋白与VEGF增强子、Flt-1启动子序列的EMSA凝胶图像分析结果 15
2.2.3 HIF-1蛋白与Flt-1启动子序列的EMSA实验观察结果 15
2.3 分析与讨论 16
2.4 小结 19
3 低氧及运动促进HIF-1α表达对大鼠肌组织VEGF、Flt-1 mRNA的影响 20
3.1 材料与方法 21
3.1.1 实验仪器 21
3.1.2 实验试剂及药品 22
3.1.3 实验对象及分组 23
3.1.4 运动训练安排 23
3.1.5 低氧处理 24
3.1.6 实验取材 24
3.1.7.2 HIF-1α免疫组织化学标本制作 25
3.1.7 实验方法 25
3.1.7.1 动脉血气分析 25
3.1.7.3 VEGF、Flt-1 mRNA原位杂交标本制作 26
3.1.7.4 免疫组织化学及原位杂交显微图像分析 27
3.1.8 统计分析 27
3.2 实验结果 28
3.2.1 大鼠动脉血气指标检测 28
3.2.1.1 动脉血气指标PaO2、O2sat、O2cont检测结果 28
3.2.2 大鼠肌组织HIF-1α免疫组织化学及显微图像分析结果 29
3.2.2.1 心肌组织HIF-1α免疫组织化学观察结果 29
3.2.1.2 PaO2析因试验结果的方差分析 29
3.2.2.2 心肌组织HIF-1α免疫组织化学染色的显微图像分析结果 31
3.2.2.3 心肌组织HIF-1α免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析 31
3.2.2.4 骨骼肌组织HIF-1α免疫组织化学观察结果 32
3.2.2.5 骨骼肌组织HIF-1α免疫组织化学染色显微图像分析结果 32
3.2.2.6 骨骼肌组织HIF-1α免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析 33
3.2.3 大鼠肌组织VEGF mRNA原位杂交及显微图像分析 34
3.2.3.1 心肌组织VEGF mRNA原位杂交观察结果 34
3.2.3.2 心肌组织VEGF mRNA原位杂交显微图像分析结果 35
3.2.3.3 心肌组织VEGF原位杂交染色析因试验结果的方差分析 36
3.2.3.4 骨骼肌组织VEGF mRNA原位杂交观察结果 36
3.2.3.5 骨骼肌组织VEGF mRNA原位杂交显微图像分析结果 37
3.2.3.6 骨骼肌组织VEGF mRNA原位杂交染色析因试验结果的方差分析 38
3.2.4 大鼠肌组织Flt-1 mRNA原位杂交及显微图像分析 39
3.2.4.1 心肌组织Flt-1 mRNA原位杂交观察结果 39
3.2.4.2 心肌组织Flt-1 mRNA原位杂交染色显微图像分析结果 40
3.2.4.3 心肌组织Flt-1 mRNA原位杂交染色析因试验结果的方差分析 40
3.2.4.4 骨骼肌组织Flt-1 mRNA原位杂交观察结果 41
3.2.4.5 骨骼肌组织Flt-1 mRNA原位杂交显微图像分析结果 42
3.2.4.6 骨骼肌组织Flt-1 mRNA原位杂交染色析因试验结果的方差分析 42
3.2.6.1 心肌组织VEGF mRNA、Flt-1 mRNA与HIF-1α相关分析结果 43
3.2.6 大鼠肌组织VEGF mRNA、Flt-1 mRNA与HIF-1α相关分析 43
3.2.5 大鼠肌组织HIF-1α免疫组织化学染色阳性指数与PaO2相关分析 43
3.2.6.2 骨骼肌组织VEGF mRNA、Flt-1 mRNA与HIF-1α相关分析 44
3.3 分析与讨论 45
3.3.1 低氧及运动对大鼠动脉血氧合状态的不同作用 45
3.3.2 低氧及运动大鼠动脉血氧合状态的改变对肌组织HIF-1α蛋白表达的影响 46
3.3.3 低氧及运动对大鼠肌组织VEGF、Flt-1 mRNA的影响 48
3.3.4 HIF-1α对肌组织VEGF、Flt-1 mRNA的促进作用 50
3.4 小结 51
4 VEGF、Flt-1促进低氧及运动大鼠肌组织血管生成的作用 52
4.1.3 实验动物饲养及分组 53
4.1.2 实验试剂及药品 53
4.1 材料与方法 53
4.1.1 实验仪器 53
4.1.4 运动训练安排 54
4.1.5 低氧处理 54
4.1.6 取材及制备 55
4.1.7 实验方法 55
4.1.7.1 血清VEGF含量的酶联免疫吸附检测 55
4.1.7.2 VEGF、Flt-1、CD34免疫组织化学标本制作 56
4.1.7.3 VEGF、Flt-1、CD34免疫组织化学显微图像分析 56
4.1.7.4 微血管密度参数的测算方法 57
4.2.1 大鼠血清VEGF含量的酶联免疫吸附检测 58
4.2.1.1 血清VEGF含量的酶联免疫吸附检测结果 58
4.1.8 统计分析 58
4.2 实验结果 58
4.2.1.2 血清VEGF含量析因试验结果的方差分析 59
4.2.2 大鼠肌组织VEGF免疫组织化学染色及图像分析 59
4.2.2.1 心肌组织VEGF免疫组织化学染色观察结果 59
4.2.2.2 心肌组织VEGF免疫组织化学染色的图像分析结果 61
4.2.2.3 心肌组织VEGF免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析 61
4.2.2.4 骨骼肌组织VEGF免疫组织化学染色观察结果 62
4.2.2.5 骨骼肌组织VEGF免疫组织化学染色的图像分析结果 62
4.2.3.1 心肌组织Flt-1免疫组织化学染色观察结果 64
4.2.2.6 骨骼肌组织VEGF免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析 64
4.2.3 大鼠肌组织Flt-1免疫组织化学染色及图像分析 64
4.2.3.2 心肌组织Flt-1免疫组织化学染色的图像分析结果 65
4.2.3.3 心肌组织Flt-1免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析 66
4.2.3.4 骨骼肌组织Flt-1免疫组织化学染色观察结果 66
4.2.3.5 骨骼肌组织Flt-1免疫组织化学染色的图像分析结果 67
4.2.3.6 骨骼肌组织Flt-1免疫组织化学染色析因试验 68
结果的方差分析 68
4.2.4.2 心肌组织微血管体视学分析结果 69
4.2.4.3 心肌组织微血管密度参数析因试验结果的方差分析 69
4.2.4.1 心肌组织CD34免疫组织化学染色观察结果 69
4.2.4 大鼠肌组织CD34免疫组织化学染色及微血管体视学分析 69
4.2.4.4 骨骼肌组织CD34免疫组织化学染色观察结果 71
4.2.4.5 骨骼肌组织微血管体视学分析结果 72
4.2.4.6 骨骼肌组织微血管密度参数析因试验结果的方差分析 72
4.2.5 大鼠肌组织微血管密度与血清VEGF含量的相关分析 73
4.2.5.1 心肌组织微血管密度与血清VEGD含量的相关分析结果 73
4.2.5.2 骨骼肌组织微血管密度与血清VEGF含量的相关分析结果 74
4.2.6 大鼠肌组织微血管密度与VEGF阳性指数的相关分析 74
4.2.6.1 心肌组织微血管密度与VEGF阳性指数的相关分析结果 74
4.2.6.2 骨骼肌组织微血管密度与VEGF阳性指数的相关分析结果 75
4.2.7.2 骨骼肌组织微血管密度与Flt-1阳性指数的相关分析结果 76
4.2.7 大鼠肌组织微血管密度与Flt-1阳性指数的相关分析 76
4.2.7.1 心肌组织微血管密度与Flt-1阳性指数的相关分析结果 76
4.3 分析与讨论 77
4.3.1 低氧及运动对大鼠肌组织微血管数量的影响 77
4.3.2 低氧及运动影响大鼠肌组织VEGF、Flt-1蛋白含量对肌组织微血管生成的促进作用 80
4.3.3 低氧及运动影响大鼠血浆VEGF含量对肌组织微血管生成的促进作用 82
4.4 小结 83
5 低氧及运动大鼠肌组织血管生成方式的超微结构研究 84
5.1.1 实验仪器 85
5.1.2 实验试剂及药品 85
5.1 材料与方法 85
5.1.3 实验对象及分组 86
5.1.4 运动训练安排 86
5.1.5 低氧处理 87
5.1.6 实验取材 87
5.1.7 电镜标本制作 87
5.2 实验结果 88
5.2.1 大鼠心肌组织毛细血管、肌纤维超微结构透射电镜观察 88
5.2.1.1 心肌组织毛细血管透射电镜观察结果 88
5.2.2 大鼠骨骼肌组织毛细血管、肌纤维超微结构透射电镜观察 90
5.2.2.1 骨骼肌组织毛细血管透射电镜观察结果 90
5.2.1.2 心肌组织肌纤维透射电镜观察结果 90
5.2.2.2 骨骼肌组织肌纤维透射电镜观察结果 91
5.3 分析与讨论 94
5.3.1 低氧及运动对大鼠肌组织毛细血管超微结构的影响 94
5.3.2 低氧及运动对大鼠肌纤维超微结构的影响 96
5.4 小结 97
6 结论 99
致谢 101
参考文献 103
附录A 运动肌组织血管生成的低氧适应机制研究进展 113
A.1 低氧介导HIF-1α对血管生成缺氧诱导基因转录的调控 114
A.1.1 VEGF、Flt-1基因的HIF-1 DNA结合位点的确定 115
A.1.2 低氧对HIF-1α与VEGF基因DNA结合活性的影响 116
A.1.3 低氧介导HIF-1α对VEGF、Flt-1的转录活性 117
A.2 低氧对运动肌组织血管生成的作用 118
A.2.1 低氧对运动骨骼肌血管生成的作用 118
A.2.2 低氧或运动对心肌血管生成的作用 121
A.3 低氧对运动肌组织HIF-1α、VEGF、Flt-1基因表达的影响 122
A.3.1 低氧运动对肌组织HIF-1α的影响 122
A.3.2 低氧运动对肌组织血管生成低氧诱导基因的影响 122
A.3.3 低氧运动下HIF-1α调节肌组织血管生成低氧反应基因的研究 124
附录B 文献综述参考文献 126