第一章 简介 1
1.1背景信息 1
1.1.1什么是HPLC？ 1
1.1.2 HPLC能用作什么？ 2
1.2 HPLC的历史简介 4
1.3 HPLC的一些替代技术 6
1.3.1气相色谱法（GC） 6
1.3.2薄层色谱法（TLC） 6
1.3.3超临界流体色谱法（SFC） 6
1.3.4毛细管电泳法（CE） 6
1.3.5逆流色谱法 7
1.3.6 HPLC的特殊形式 7
1.4 HPLC的其他信息资料 7
1.4.1书籍 7
1.4.2期刊 7
1.4.3 综述 7
1.4.4 短期课程 8
1.4.5互联网 8
第二章 基础概念和色谱分离的控制 11
2.1介绍 11
2.2色谱分析的过程 11
2.3保留 13
2.3.1保留因子К和色谱柱的死时间to 13
2.3.2分离条件和样品组成的角色 15
2.4峰宽和柱塔板数N 18
2.4.1 N对色谱条件的依赖性 19
2.4.2峰形 25
2.5分离度和方法建立 26
2.5.1优化保留因子К（等式2-24中的a项） 28
2.5.2优化选择性α（等式2-24中的b项） 29
2.5.3优化色谱柱的塔板数N（等式2-24中的c项） 30
2.5.4方法建立 32
2.6进样量大小的影响 34
2.6.1体积超载：样品体积对分离效果的影响 34
2.6.2质量超载：样品重量对分离效果的影响 35
2.6.3避免进样过多所引起的问题 36
2.7其他相关的问题 36
2.7.1色谱柱平衡 37
2.7.2梯度洗脱 37
2.7.3峰容量和二维分离 37
2.7.4峰跟踪 38
2.7.5二次平衡 39
2.7.6 色谱柱切换 39
2.7.7基于溶质的结构预测保留时间 40
第三章 设备 44
3.1介绍 44
3.2储液瓶和溶剂的过滤 45
3.2.1储液瓶的设计和使用 45
3.2.2流动相的过滤 46
3.3流动相的脱气 46
3.3.1脱气的要求 46
3.3.2氦气喷洗 47
3.3.3真空和管内脱气 47
3.4管线和接头 48
3.4.1管线 48
3.4.2接头 49
3.5泵系统 52
3.5.1往复活塞泵 52
3.5.2在线混合 53
3.5.3梯度系统 55
3.5.4特殊应用 55
3.6自动进样器 56
3.6.1六通口进样阀 56
3.6.2自动进样器的设计 57
3.6.3进样量大小的影响 60
3.6.4阀门的其他应用 61
3.7色谱柱恒温箱 62
3.7.1温度控制的要求 62
3.7.2恒温箱的设计 63
3.8数据系统 63
3.8.1实验的辅助 63
3.8.2系统控制 64
3.8.3数据采集 64
3.8.4数据处理 64
3.8.5报告生成 65
3.8.6 监管的功能 65
3.9柱外效应 65
3.10设备维护 65
3.10.1系统性能测试 65
3.10.2预防性维护 68
3.10.3维修 70
第四章 检测器 73
4.1介绍 73
4.2检测器的特征 74
4.2.1一般设计 74
4.2.2检测技术 75
4.2.3信号、噪声、漂移和分析精确度 75
4.2.4检测限 77
4.2.5线性 78
4.3各类检测器的介绍 78
4.4 UV-可见光检测器 79
4.4.1固定波长检测器 80
4.4.2可变波长检测器 80
4.4.3二极管阵列检测器 80
4.4.4一般UV检测器的特征 81
4.5荧光检测器 82
4.6电化学（安培）检测器 83
4.7放射性检测器 84
4.8电导检测器 85
4.9氮化学发光检测器 85
4.10手性检测器 86
4.11示差折光检测器 87
4.12光散射检测器 88
4.12.1蒸发光散射检测器（ELSD） 88
4.12.2凝结核光散射检测器（CNLSD） 89
4.12.3激光光散射检测器（LLSD） 89
4.13电晕放电检测器（CAD） 90
4.14质谱检测器（MS） 90
4.14.1接口 90
4.14.2四极杆和离子阱 91
4.14.3其他质谱检测器 92
4.15 其他的联用检测器 92
4.15.1（傅里叶变换）红外光谱仪（FTIR） 93
4.15.2核磁共振（NMR） 93
4.16样品衍生化和反应检测器 94
第五章 色谱柱 97
5.1介绍 97
5.2色谱柱载体 97
5.2.1颗粒特征 98
5.2.2硅胶载体 99
5.2.3多孔聚合物 102
5.2.4整体柱 103
5.2.5其他无机颗粒 104
5.3固定相 105
5.3.1“键合”固定相 106
5.3.2其他基于有机物的固定相 108
5.3.3柱子的功能性（配合基种类） 109
5.4色谱柱的选择性 110
5.4.1反相柱（RPC）选择性的基础 110
5.4.2柱子重现性和“等同的”柱子 114
5.4.3正交分离 115
5.4.4柱子选择性的其他应用 115
5.5色谱柱的硬件 116
5.5.1柱子接头 116
5.5.2柱子配置 116
5.6 色谱柱的填充方法 117
5.6.1干填充法 117
5.6.2硬颗粒的匀浆填充法 117
5.6.3软凝胶 118
5.7柱子的规格 118
5.7.1生产标准 118
5.7.2柱子塔板数 119
5.8色谱柱的处理 120
第六章 中性样品的反相色谱法 124
6.1介绍 124
反相色谱法的简单历史回顾 125
6.2保留 125
6.2.1溶剂强度 126
6.2.2反相色谱的保留过程 126
6.3选择性 128
6.3.1溶剂强度选择性 128
6.3.2溶剂类型选择性 130
6.3.3温度选择性 131
6.3.4 色谱柱的选择性 133
6.3.5异构体分离 133
6.3.6其他的选择性考量 135
6.4方法建立和优化选择性的策略 139
6.4.1多变量优化 140
6.4.2优化色谱柱的条件 143
6.5非水性反相色谱法 144
6.6特殊问题 145
6.6.1极性很强的样品保留较弱 145
6.6.2色谱峰拖尾 145
第七章 离子样品：反相、离子对和离子交换色谱法 148
7.1介绍 148
7.2酸碱平衡和反相保留 148
7.2.1缓冲液的选择 152
7.2.2 pKa与化合物结构的函数关系 154
7.2.3有机溶剂和温度对流动相pH和样品pKa值的影响 155
7.3反相色谱（RPC）对离子化合物的分离 155
7.3.1调控保留时间 156
7.3.2控制选择性 156
7.3.3方法的建立 160
7.3.4特殊的问题 160
7.4离子对色谱法（IPC） 161
7.4.1保留的基本原理 162
7.4.2方法建立 165
7.4.3特殊问题 168
7.5离子交换色谱法（IEC） 169
7.5.1保留的基本原理 170
7.5.2反离子的角色 170
7.5.3流动相的pH 171
7.5.4 IEC柱 171
7.5.5其他条件的角色 171
7.5.6方法建立 171
7.5.7碳水化合物的分离 172
7.5.8混合模式的分离 172
第八章 正相色谱 175
8.1简介 175
8.2正相色谱的保留行为 176
8.2.1理论 177
8.2.2 B溶剂和%B对溶剂强度的影响 180
8.2.3以TLC的数据预测NPC的保留行为 180
8.3选择性 182
8.3.1溶剂强度的选择性 182
8.3.2溶剂类型的选择性 182
8.3.3温度的选择性 184
8.3.4 色谱柱的选择性 184
8.3.5异构体的分离 186
8.4方法建立的总结 187
8.4.1 NPC方法建立的初始条件：流动相强度和色谱柱类型的选择 188
8.4.2选择性优化的策略 189
8.4.3 NPC方法建立示例 189
8.5 NPC应用的常见问题 191
8.5.1重现性不佳 191
8.5.2溶剂分层和平衡时间过长 191
8.5.3 色谱峰拖尾 192
8.6亲水作用色谱法 192
8.6.1保留机制 192
8.6.2色谱柱 193
8.6.3亲水作用色谱方法建立 193
8.6.4 亲水作用色谱的常见问题 194
第九章 梯度洗脱 197
9.1引言 197
9.1.1使用梯度洗脱的其他原因 198
9.1.2梯度的形状 199
9.1.3等度洗脱和梯度洗脱的相似之处 199
9.2实验条件及它们对分离的影响 202
9.2.1 色谱柱条件改变的影响 203
9.2.2梯度洗脱条件改变的影响 204
9.2.3“非常规”的样品 209
9.2.4 定量测定的关系 210
9.3方法建立 212
9.3.1起始的梯度分离 212
9.3.2优化К 216
9.3.3优化梯度选择性α 216
9.3.4优化梯度范围 216
9.3.5分段（非线性）洗脱 217
9.3.6优化色谱柱的塔板数N 217
9.3.7测量色谱柱的必要平衡时间 217
9.3.8方法的重现性 218
9.3.9色谱峰容量和快速分离 219
9.3.10全面的二维HPLC 222
9.4大分子的分离 225
9.5其他分离模式 226
9.5.1理论 226
9.5.2正相色谱法NPC） 226
9.5.3亲水作用色谱法（HILIC） 226
9.5.4离子交换色谱法（IEC） 227
9.6问题 228
9.6.1溶剂混合 228
9.6.2鬼峰 228
9.6.3基线漂移 228
第十章 计算机辅助的方法开发 231
10.1介绍 231
10.1.1计算机模拟的基础和历史 231
10.1.2什么时候使用计算机模拟 233
10.2计算机模拟软件 234
10.2.1 DryLab操作 234
10.2.2梯度优化 235
10.2.3其他特点 235
10.2.4色谱峰跟踪 238
10.2.5计算机模拟软件的来源 239
10.3其他方法建立的软件 239
10.3.1溶质保留和分子结构 239
10.3.2溶质pKa值与分子结构 239
10.3.3反相色谱柱的选择 239
10.3.4用于方法建立的专家系统 239
10.4计算机模拟与方法建立 239
10.4.1举例1：药物混合物的分离 240
10.4.2举例2：方法建立的不同策略 240
10.4.3验证方法的耐受性 241
10.4.4总结 241
第十一章 定性与定量分析 244
11.1介绍 244
11.2信号测量 244
11.2.1积分操作 244
11.2.2保留 247
11.2.3峰的大小 248
11.2.4误差的来源 248
11.2.5检测限 250
11.3定性分析 251
11.3.1保留时间 252
11.3.2在线定性分析 252
11.4定量分析 253
11.4.1校正 253
11.4.2痕量分析 258
11.5总结 258
第十二章 方法验证 260
12.1前言 260
12.2术语及定义 261
12.2.1准确度 262
12.2.2精确度 262
12.2.3专属性 263
12.2.4检测限及定量限 263
12.2.5线性及范围 263
12.2.6耐受性 264
12.3系统适应性 264
12.4文件 265
12.4.1确证草案 265
12.4.2检测方法 265
12.4.3确证报告 266
12.5不同药品分析方法的确证 266
12.5.1第一类方法 266
12.5.2第二类方法 266
12.5.3第三类方法 267
12.5.4第四类方法 267
12.6生物分析方法 267
12.6.1参考标准物的制备 267
12.6.2生物分析法的建立与确证 267
12.6.3生物分析法常规应用 269
12.6.4生物分析法文件 269
12.7分析方法的移交（AMT） 269
12.7.1分析方法移交选项 270
12.7.2 AMT精要 271
12.7.3 AMT潜在缺陷 272
12.8方法调整或方法修正 272
12.8.1 pH的调试 273
12.8.2缓冲盐溶液的浓度 273
12.8.3流动相组成成分的比例 273
12.8.4紫外可见光检测器的波长 274
12.8.5温度的调节 274
12.8.6柱长、直径和颗粒大小的调整 274
12.9质量控制和质量保证 274
12.9.1质量控制 274
12.9.2质量保证 274
12.10总结 274
第十三章 生物化学与合成聚合物的分离 277
13.1生物大分子 277
13.2分子的结构与构象 277
13.2.1肽类和蛋白质（多肽） 278
13.2.2核酸 280
13.2.3碳水化合物 281
13.2.4病毒 281
13.3生物分子高效液相色谱的特殊考虑 281
13.3.1色谱柱的特性 283
13.3.2蛋白质结构对色谱行为的影响 284
13.4肽类和蛋白质的分离 285
13.4.1反相色谱法（RPC） 285
13.4.2离子交换色谱（IEC）和相关技术 291
13.4.3疏水性相互作用色谱（HIC） 297
13.4.4亲水作用色谱（HILIC） 298
13.4.5多维液相色谱（MDLC）在蛋白质组学上的应用 300
13.5核苷酸分离 301
13.5.1阴离子交换色谱 301
13.5.2反相色谱 302
13.5.3疏水作用色谱分析法 304
13.6分离碳水化合物 305
13.6.1亲水作用色谱 305
13.6.2离子对分配色谱 306
13.6.3高效阴离子交换色谱 306
13.7病毒的分离 306
13.8尺寸排阻色谱法（SEC） 308
13.8.1尺寸排阻色谱法的保留过程 308
13.8.2凝胶过滤色谱柱 309
13.8.3凝胶过滤的流动相 310
13.8.4操作的考虑因素 310
13.8.5 SEC的优点和局限性 311
13.8.6 SEC的应用 311
13.9生物大分子的大规模纯化 312
13.9.1背景 312
13.9.2重组人胰岛素的生产规模的纯化 312
13.9.3制备液相色谱分离蛋白质的一般要求 315
13.10合成聚合物 315
13.10.1背景 315
13.10.2聚合物的分析技术 316
13.10.3聚合物分析的液相色谱模式 317
13.10.4二维色谱分离聚合物 319
第十四章 对映异构体的分离 325
14.1引言 325
14.2背景和定义 325
14.2.1异构和手性 326
14.2.2手性的识别和对映异构体的分离 327
14.3间接方法 327
14.4直接方法 329
14.4.1手性流动相-添加物模式（CMPA） 329
14.4.2手性固定相模式（CSP） 330
14.4.3手性识别的原则 331
14.5色谱峰的展宽和拖尾 332
14.6手性固定相和它们的特征 332
14.6.1基于多糖的CSPs 332
14.6.2合成聚合物CSPs 336
14.6.3蛋白质相 338
14.6.4基于环糊精的CSPs 341
14.6.5大环抗生素CSPs 342
14.6.6手性冠醚CSPs 346
14.6.7供体-受体相 346
14.6.8手性离子交换剂 348
14.6.9手性配体-交换CSPs 350
14.7热力学的考虑 350
14.7.1溶质-选择剂结合的热力学问题 350
14.7.2对映异构体直接色谱分离法的热力学问题 351
14.7.3位点选择性的热力学问题 351
第十五章 制备色谱 357
15.1引言 357
15.1.1色谱柱超载及其后果 357
15.1.2分离的规模 358
15.2制备-LC分离的装置 359
15.2.1色谱柱 359
15.2.2样品引入 359
15.2.3检测器 360
15.2.4试样收集 361
15.2.5产品回收（流动相的去除） 361
15.3等度洗脱 362
15.3.1样品重量和分离 362
15.3.2触-峰分离 363
15.4严重超载的分离 366
15.4.1回收率与纯度 366
15.4.2方法建立 366
15.5梯度洗脱 368
15.5.1等度和梯度制备-LC的比较 368
15.5.2梯度制备-LC的方法建立 369
15.6大规模分离 370
第十六章 样品的制备 371
16.1引言 371
16.2样品的类别 372
16.3固体和半固体样品的初步处理 373
16.3.1样品颗粒的减小 373
16.3.2样品的干燥 373
16.3.3 过滤 373
16.4液体样品的制备 374
16.5液-液萃取 374
16.5.1理论 374
16.5.2实践 375
16.5.3问题 376
16.5.4液-液萃取的特殊方法 376
16.6固相萃取 377
16.6.1 SPE和HPLC比较 377
16.6.2使用SPE 377
16.6.3 SPE的仪器 378
16.6.4 SPE的工具 379
16.6.5 SPE方法建立 380
16.6.6 SPE方法建立的例子：从人血浆中分离沙丁胺醇 381
16.6.7 SPE中的特殊问题 383
16.7样品制备中的膜技术 385
16.8固体样品的制备方法 385
16.8.1传统萃取方法 385
16.8.2现代固体萃取方法 387
16.9色谱柱的切换 388
16.10生物色谱法的样品配备 388
16.11 LC-MS的样品配备 389
16.12应用于HPLC的衍生化技术 390
第十七章 故障排除 395
快速修复 395
17.1前言 395
17.2如何阻止问题的产生 396
17.2.1系统表现测试 396
17.2.2周期性的维护 396
17.2.3系统适应性测试 396
17.2.4历史记录 397
17.2.5建议和技巧 397
17.3故障分割的策略 399
17.3.1划分与征服 399
17.3.2简易的与有效的 400
17.3.3 每次只改变一个变量 400
17.3.4解决重现性的问题 400
17.3.5单元组件的替换 400
17.3.6还原 400
17.4 HPLC故障的常见特征 400
17.4.1漏泄 400
17.4.2非正常的压力 404
17.4.3保留时间的变动 406
17.4.4 峰面积 408
17.4.5其他与色谱有关的故障 409
17.4.6系统表现测试的解析 417
17.5故障排除的表格 421
附录Ⅰ HPLC溶剂的特点 427
Ⅰ.1溶剂-检测器兼容性 427
Ⅰ.1.1 UV检测 427
Ⅰ.1.2 RⅠ检测器 427
Ⅰ.1.3 MS检测器 427
Ⅰ.2溶剂的极性与选择性 429
Ⅰ.3溶剂安全性 429
附录Ⅱ缓冲流动相的制备 432
Ⅱ.1操作顺序 432
Ⅱ.2常用缓冲液的制法 432