1.1 蛋白质纯化的意义 1
1.2 纯化蛋白质常用的方法 1
1 绪论 1
1.3 蛋白质纯化的设计 2
1.3.1 基本原则 2
1.3.2 过程优化 3
1.3.3 经济性 4
1.4 规模化蛋白质纯化 5
1.4.1 基本原则 5
1.4.2 主要操作过程 6
2 蛋白质样品的预处理 11
2.1 蛋白质样品的提取和分离 11
2.1.1 细胞的破碎 12
2.1.2 蛋白质样品的分离 15
2.2 蛋白质样品的浓缩 17
2.2.2 超滤法 18
2.2.1 吸附法 18
2.2.3 沉淀法 20
2.2.4 透析法 21
2.2.5 冷冻干燥法 21
2.2.6 双水相分离法 21
2.3 蛋白质样品的沉淀 22
2.3.1 盐析法 23
2.3.2 有机溶剂沉淀法 25
2.3.3 等电点沉淀法 26
2.3.4 聚乙二醇沉淀法 26
2.3.5 选择性沉淀法 27
2.4 蛋白质样品的透析 27
2.4.1 基本原理 27
2.4.2 应用 28
3.1 概述 29
3.1.1 基本原理 29
3 凝胶过滤色谱 29
3.1.2 凝胶的性质和种类 36
3.1.3 凝胶介质的选择 41
3.2 凝胶柱的操作 42
3.2.1 装柱 42
3.2.2 样品和缓冲液的准备 46
3.2.3 色谱条件 47
3.2.4 加样和洗脱 48
3.2.5 凝胶柱的再生及保存 49
3.3 应用 49
3.3.1 脱盐 49
3.3.2 蛋白质分离 50
3.3.3 测定蛋白质分子量 51
3.3.4 蛋白质复性的研究 51
3.3.5 其他 52
4 离子交换色谱 53
4.1 基本概念 54
4.1.1 蛋白质的电性质 55
4.1.2 离子交换理论 60
4.1.3 离子交换的分辨率 62
4.2 固定相：离子交换剂 66
4.2.1 基本结构 66
4.2.2 功能基团和酸碱性质 67
4.2.3 离子交换剂的部分性质 68
4.2.4 离子交换剂的类型 74
4.3 流动相：缓冲液和盐 86
4.3.1 缓冲液的类型 87
4.3.2 缓冲液的pH和浓度 88
4.3.3 离子对色谱行为的影响 89
4.3.4 添加剂 90
4.4 实验方案设计 91
4.4.1 离子交换剂的选择 91
4.4.2 缓冲液的选择和色谱条件的确定 94
4.4.3 色谱柱的尺寸 98
4.4.4 分批分离 99
4.5 色谱技术 100
4.5.1 离子交换剂的准备 100
4.5.2 样品的准备 102
4.5.3 加样 103
4.5.4 洗脱技术 105
4.5.5 样品的收集和处理 113
4.5.6 离子交换剂的再生、清洗、消毒和储存 114
4.6 应用实例 115
4.6.1 用DEAE-Sepharose色谱分离真菌纤维素酶 115
4.6.2 用Mono S和Mono Q连续色谱法从鸡肌肉组织分级分离糖酵解酶类 116
4.6.3 用Mono Q阴离子交换分离白血病细胞N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的同工酶 117
4.6.4 用Bio-Rex 70色谱分离眼镜蛇神经毒素的六种单乙酰基衍生物 118
4.6.5 用阶段洗脱法大规模纯化人血清白蛋白和免疫球蛋白G 119
5 亲和色谱 120
5.1.1 配体和载体的选择 121
5.1 亲和吸附剂 121
5.1.2 亲和吸附剂的制备方法 123
5.1.3 商品化基团特异性吸附剂 128
5.2 色谱技术 130
5.2.1 亲和色谱操作过程 130
5.2.2 亲和色谱的操作注意事项 132
5.2.3 亲和色谱的吸附容量与吸附效率 132
5.3 亲和色谱的特殊类型 133
5.3.1 凝集素亲和色谱 133
5.3.2 免疫亲和色谱 137
5.3.3 环氧乙烷丙烯酰胺珠亲和色谱 140
5.3.4 金属螯合亲和色谱 142
5.3.5 疏水作用色谱 144
5.4.4 脂蛋白的纯化 145
5.4.2 酶的纯化 145
5.4.3 糖蛋白的纯化 145
5.4 应用 145
5.4.1 抗体和抗原的纯化 145
6 共价色谱 146
6.1 巯基的化学性质 147
6.1.1 离子化、氧化、金属联结、烷基化 147
6.1.2 巯基-二硫化物互换反应 148
6.1.3 与活性二硫化物的反应 149
6.1.4 巯基与二硫氧化物的反应 150
6.2 含巯基的蛋白质 151
6.2.1 生物体中的氧化还原态 151
6.2.2 胞内与胞外的蛋白质 151
6.2.3 蛋白质巯基基团的解蔽 151
6.2.6 巯基基团的衍生化作用 152
6.3 共价色谱的凝胶 152
6.3.1 原理 152
6.2.5 巯基的引入 152
6.2.4 蛋白质二硫键的还原 152
6.3.2 凝胶的基质 153
6.3.3 凝胶的固定相 153
6.3.4 固定相活性基团的比较 153
6.3.5 凝胶固定相的引入 155
6.3.6 凝胶的取代程度和实际容量 157
6.4.2 蛋白样品的结合 158
6.4.1 预备 158
6.4 色谱技术 158
6.4.3 洗涤 159
6.4.4 还原洗脱 159
6.4.5 巯基蛋白的回收 160
6.4.6 巯基凝胶的再生 161
6.4.7 反向共价色谱 162
6.5 应用实例 162
6.5.1 从刀豆中分离脲酶 162
6.5.2 木瓜蛋白酶的纯化 163
6.5.3 共价色谱的顺序洗脱 164
6.5.4 巯基多肽的纯化 165
6.5.5 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的可逆固定 165
6.5.6 蛋白质亚基的鉴定 166
7 电泳技术 167
7.1 概述 167
7.1.1 原理 167
7.1.2 分类 169
7.1.3 介质 170
7.1.4 电泳仪器 172
7.1.5 染色方法 173
7.2 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 174
7.2.1 原理 174
7.2.2 常规PAGE的类型 175
7.2.3 影响分离结果的外在因素 175
7.2.4 蛋白质分子量的测定 176
7.2.5 常规PAGE的实验方法 177
7.2.6 PAGE的应用范围 181
7.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 181
7.3.1 原理 181
7.3.2 SDS-PAGE的类型 182
7.3.3 影响分离结果的外在因素 182
7.3.4 蛋白质分子量的测定 183
7.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法 183
7.3.6 SDS-PAGE的应用范围 184
7.4 等电聚焦 184
7.4.1 原理 185
7.4.2 载体两性电解质pH梯度的形成 186
7.4.3 载体两性电解质等电聚焦方法 187
7.4.4 固相pH梯度的介质及其pH梯度的形成 189
7.4.5 固相pH梯度等电聚焦方法 192
7.5.2 双向电泳实验方法 194
7.5.1 原理 194
7.5 双向电泳 194
7.4.6 等电聚焦的应用范围 194
7.5.3 应用 196
7.6 免疫电泳 197
7.6.1 原理 197
7.6.2 电泳方法 199
7.6.3 应用 200
7.7 蛋白质印迹 200
7.7.1 原理 200
7.7.2 试验材料的选择 201
7.7.3 蛋白质印迹试验方法 202
7.7.4 应用 203
7.8 毛细管电泳 203
8 特殊用途蛋白质的纯化 204
8.1 测序用蛋白质的纯化 204
8.1.1 测序蛋白纯化技术 205
8.1.2 多肽的制备和纯化 207
8.2 用于晶体学研究的蛋白质纯化 208
8.2.1 蛋白质结晶方法 211
8.2.2 不均一性对蛋白质结晶的影响 214
8.3 融合蛋白的纯化 218
8.3.1 融合蛋白的纯化过程 219
8.3.2 蛋白质的水解保护 225
8.3.3 常用融合技术 227
8.3.4 融合蛋白纯化实例 231
8.4 包含体的初步纯化 233
8.4.1 影响包含体形成的因素 233
8.4.2 细胞匀浆中包含体的分离 233
8.4.3 包含体的洗涤 233
8.5 膜蛋白的纯化 234
8.5.1 蛋白质的溶解性 235
8.5.2 膜蛋白的纯化 237
8.6 治疗用蛋白质的纯化 238
8.6.1 治疗用蛋白纯化的关键问题 239
8.6.2 工艺确认 242
9 不同来源蛋白质的纯化 244
9.1 微生物细胞培养蛋白质的纯化 244
9.1.1 色谱纯化方法 244
9.1.2 蛋白质离子交换纯化 245
9.2 哺乳动物细胞培养蛋白质的纯化 250
9.2.1 工艺设计 251
9.2.2 细胞分离 252
9.2.3 产品的初步回收和分离 252
9.2.4 主要纯化方法 252
9.2.5 样品纯化举例——单克隆抗体的纯化 253
9.2.6 消除污染 254
9.3 动物组织蛋白质的纯化 256
9.3.1 组织的选择 256
9.3 亚细胞分级分离 257
9.3.3 防止蛋白质的有害水解 257
9.3.2 组织破碎 257
9.3.5 膜蛋白的溶解 259
9.3.6 动物蛋白质纯化举例 260
9.4 植物组织蛋白质的纯化 263
9.4.1 影响植物组织蛋白质纯化的因素 263
9.4.2 材料来源 263
9.4.3 确定植物蛋白种类的直接和间接策略 267
9.4.4 样品纯化举例 268
10 蛋白质的常用指标分析 271
10.1 蛋白质的含量分析 271
10.1.1 测定蛋白质浓度的方法 271
10.1.2 紫外分光光度法 271
10.1.3 Lowry法 274
10.1.4 二喹啉甲酸检测法 277
10.1.5 考马斯亮蓝染色法 278
10.2 蛋白质的分子量测定 281
10.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的分子量 282
10.2.2 凝胶过滤色谱法测定天然蛋白质的分子量 286
10.3 蛋白质的等电点测定 288
10.3.1 蛋白质的等电点 288
10.3.2 等电聚焦技术 289
10.3.3 超薄聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定蛋白质的等电点 289
10.4 蛋白质的纯度分析 294
10.4.1 纯度标准 294
10.4.2 常用的纯度检测方法 294
10.5 糖蛋白质中的糖含量分析 296
10.5.1 糖蛋白的化学分析 296
10.5.2 SDS凝胶中的糖蛋白染色法 297
10.6 蛋白质和肽的N末端氨基酸测定 299
10.6.1 FDNB法 300
10.6.2 DNS分析法 301
10.6.3 Edman降解法 304
10.7 蛋白质N末端序列分析 306
10.7.1 DNS-Edman法 308
10.7.2 DABITC/PITC双偶合法 309
10.8 蛋白质和肽的C末端分析 313
10.8.1 概述 313
10.8.2 C末端序列分析的羧肽酶Y法 314
11 实验部分 317
11.1 用于蛋白质纯化的仪器（工作站） 317
11.1.1 蛋白质纯化系统的主要部件 317
11.1.2 几种常见的蛋白质色谱系统 320
11.2 蛋白质分离纯化实例 322
11.2.1 蔗糖酶的分离纯化 322
11.2.2 转谷氨酰胺酶的分离纯化 323
11.2.3 纯化重组蛋白Pseudomonas aeruginosa外毒素A 325
11.2.4 E.coli中RNA聚合酶的提取和纯化 329
11.2.5 从E.coli中分离制备高纯度的去乙酰头孢菌素C合成酶 330
参考文献 334