关于《小鼠胚胎操作实验手册》的网站 1
第1章 小鼠的发育遗传学和胚胎学：过去、现在和未来 3
1.1 引言 5
1.2 孟德尔遗传和连锁：小鼠遗传学的起源 5
1.3 实验室用小鼠的起源 6
1.4 自交系小鼠的创建和小鼠遗传学的其他资源 10
1.5 小鼠发育遗传学的起源 12
1.6 实验小鼠胚胎学的继承 14
1.7 小鼠基因组的操作 16
1.8 系统寻找小鼠中的新基因及发育过程中的突变体 17
参考文献 19
第2章 小鼠发育概要 29
2.1.1 生殖细胞系的起源 31
2.1 小鼠的发育 31
2.1.2 性别决定和分化 39
2.1.3 精子发生 39
2.1.4 卵子发生 41
2.1.5 排卵 44
2.1.6 孤雌发育 45
2.1.7 受精 46
2.1.8 卵母细胞和合子的细胞骨架组装 47
2.1.9 早期卵裂：从1-细胞胚胎到8-细胞未致密化桑葚胚 48
2.1.10 用RT-PCR和cDNA文库分析胚胎基因表达 50
2.1.11 胚胎细胞核的发育潜能 51
2.1.12 致密化和胚泡形成：最早的分化事件 52
2.1.14 胚胎植入子宫 53
2.1.13 滋养外胚层和内细胞团细胞系的分离 53
2.1.15 滋养外胚层及其衍生物 55
2.1.16 原始内胚层和外胚层分化：第二轮分化 57
2.1.17 小鼠胚胎中的细胞系标记分子 57
2.1.18 原始外胚层细胞系 57
2.1.19 原肠作用：中胚层和终末内胚层的形成 62
2.1.20 原肠作用的命运图谱 65
2.1.21 中胚层中区域多样性的产生 68
2.1.22 前部脏内胚层 68
2.1.23 原结 68
2.1.24 尾芽 70
2.1.25 胚胎旋转 70
2.1.26 体节及其衍生物 70
2.1.27 侧板和间介中胚层以及它们的衍生物 74
2.1.28 四肢发生 76
2.1.29 神经化：神经系统的发生 77
2.1.30 神经管区域多样化的发生 78
2.1.31 神经嵴 79
2.1.32 鳃弓和咽区的发生 82
2.1.33 肠的发育 83
2.1.34 畸胎瘤细胞和胚胎干细胞 83
2.1.35 胚胎大小的调节 84
2.1.36 基因印迹 85
2.1.37 X染色体失活 86
2.1.38 胚外组织 87
2.1.39 胚外内胚层：原始内胚层只形成脏内胚层和壁内胚层 88
2.1.40 脏内胚层中的基因表达 89
2.1.42 胚外中胚层的分化 91
2.1.43 胎盘的结构与功能 91
2.1.41 壁内胚层中的基因表达 91
2.2 成年小鼠 93
2.2.1 小鼠毛色及其遗传学 93
2.2.2 形态及行为突变 98
参考文献 98
第3章 转基因小鼠和嵌合体小鼠的生产：一般要点 119
3.1 实验鼠群的病原控制 121
3.2 提供供体和／或受体小鼠的育种群 123
3.3 自然交配的安排 123
3.4.1 年龄和体重的影响 124
3.4 诱导超数排卵 124
3.4.2 促性腺激素的剂量 125
3.4.3 促性腺激素的注射时间 125
3.4.4 超排小鼠的品系 126
3.4.5 种公鼠的繁殖性能 126
3.5 胚胎供体和受体的生产 126
3.5.1 配种提供DNA注射用合子的母鼠 126
3.5.2 提供制作ES细胞嵌合体用囊胚或卵裂期胚胎的母鼠 127
3.5.3 繁殖力正常的种公鼠 128
3.5.4 用于诱导母鼠假孕的不育公鼠 128
3.5.5 用作假孕受体的母鼠 129
3.6 基因工程小鼠的命名 130
参考文献 131
3.7 实验方案［腹腔内（IP）注射］ 131
第4章 植入前胚胎的收集和体外培养 133
4.1 着床前胚胎的培养液 135
4.1.1 研究史 135
4.1.2 小鼠胚胎的培养液 136
4.1.3 胚胎培养液的关键成分 137
4.1.4 最新进展 139
4.2 体外胚胎培养的一般问题 141
4.2.1 培养液的准备 141
4.2.2 胚胎收集和培养 142
4.2.3 质量控制 143
4.3 胚胎培养液的准备 144
4.4 移卵管的组装 144
4.6.1 方案1 配制M16培养液 146
4.5 着床前胚胎的收集 146
4.6 实验方案 146
4.6.2 方案2 配制M2培养液 147
4.6.3 方案3 从浓储液制备M2和M16培养液 148
4.6.4 方案4 制备KSOM培养液 149
4.6.5 方案5 制备培养微滴 150
4.6.6 方案6 用玻璃毛细管拉制移卵管 151
4.6.7 方案7 玻璃移液管的硅化 152
4.6.8 方案8 打开腹腔并定位雌性生殖器官 153
4.6.9 方案9 收集合子并利用透明质酸酶去掉卵丘细胞 153
4.6.10 方案10 收集2-细胞到致密化的桑葚胚阶段的胚胎 156
4.6.11 方案11 囊胚的收集 159
参考文献 160
第5章 植入后胚胎的分离、培养和操纵 167
5.1 植入后胚胎的分离 169
5.1.1 早期胚胎着床点的观察 169
5.1.2 植入后胚胎的分离 169
5.1.3 胚外膜的剥离 169
5.1.4 植入后胚胎胚层的分离 170
5.1.5 胚层的重组和培养 170
5.1.6 从生殖嵴中分离生殖细胞 170
5.2 植入后胚胎的培养 171
5.2.1 胚胎的准备 171
5.2.2 植入后胚胎的滚筒式培养 171
5.2.3 植入后胚胎的静态式培养 171
5.3 植入后胚胎基因注射的电穿孔技术 172
5.2.4 用于摄取图像的植入后胚胎的静态式培养 172
5.4 实验方案 173
5.4.1 方案1 通过注射染料观察早期胚胎的着床点 173
5.4.2 方案2 植入后胚胎的分离 174
5.4.3 方案3 胚外膜的剥离 177
5.4.4 方案4 植入后胚胎胚层的分离 181
5.4.5 方案5 胚层的重组与培养 183
5.4.6 方案6 自生殖嵴中分离生殖细胞 184
5.4.7 方案7 植入后胚胎的旋转式培养 186
5.4.8 方案8 植入后胚胎的静态式培养 190
5.4.9 方案9 用于摄取图像的植入后胚胎的静态式培养 191
5.4.10 方案10 电穿孔技术 193
参考文献 195
第6章 外科手术方法 197
6.1 概论 199
6.2 输精管及卵巢切除术 200
6.3 胚胎移植 200
6.3.1 输卵管内胚胎移植 200
6.3.2 子宫内胚胎移植 200
6.3.3 受体雌鼠 201
6.3.4 胚胎移植的技术要点 201
6.4 剖腹产手术和子鼠寄养 202
6.5 组织移植 202
6.6 活体组织检查 202
6.7 实验方案 202
6.7.1 方案1 制作不育雄鼠的输精管切除术 202
6.7.2 方案2 诱导胚泡延迟着床的卵巢摘除术 205
6.7.3 方案3 输卵管内胚胎移植 206
6.7.4 方案4 子宫内胚胎移植 209
6.7.5 方案5 剖腹产手术和子鼠寄养 211
6.7.6 方案6 肾囊下组织移植 212
6.7.7 方案7 ES细胞的皮下注射 214
6.7.8 方案8 肝脏的部分切除术 214
6.7.9 方案9 脾切除术 215
6.7.10 方案10 肾切除术 216
6.7.11 方案11 去势术 216
6.7.12 方案12 尾动脉采血 217
参考文献 218
第7章 转基因小鼠的制备 221
7.1 小鼠转基因技术的应用 223
7.2 原核显微注射法将基因导入小鼠基因组 224
7.3.1 原核载体序列的影响 225
7.3 转基因的构建 225
7.3.2 DNA构件的长度 226
7.3.3 两种或多种转基因的共注射 226
7.3.4 转基因与内源基因的差异性表达 226
7.3.5 调控序列的鉴定方法 227
7.3.6 报告基因 227
7.3.7 转基因构件中已知组织特异性调控序列的利用 227
7.3.8 转基因表达过程中cDNA的表达以及内含子的作用 228
7.3.9 利用“管家基因”启动子指导基因的专一性表达 228
7.3.10 影响基因转移效率的相关因素 228
7.4 DNA的分离与纯化 229
7.4.1 概述 229
7.3.11 大型DNA构件相关知识概述 229
7.4.2 DNA污染物及其去除方法 230
7.4.3 推荐使用的商业化质粒制备及DNA纯化试剂盒 231
7.4.4 从细菌培养物中提取标准大小的质粒DNA 231
7.4.5 质粒DNA消化获得基因构件片段 232
7.4.6 凝胶分离 232
7.4.7 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收 233
7.4.8 DNA片段的纯化 233
7.5 显微注射用DNA的制备 233
7.5.1 DNA质量的鉴定及其维持 233
7.5.2 注射用DNA浓度的测定 234
7.6.3 固定针的制作 235
7.6.2 合子的准备 235
7.6.1 小鼠品系的选择 235
7.6 操作器械以及合子的准备 235
7.5.4 DNA的储存 235
7.5.3 DNA溶液需要过滤吗 235
7.6.4 显微注射针的制作 236
7.6.5 显微操作设备的安装 238
7.7 显微注射 241
7.7.1 原核注射的时间 241
7.7.2 小鼠合子的显微注射 241
7.7.3 注射后的胚胎操作 241
7.8 转基因小鼠品系的建立及其维持 242
7.9 实验方案 242
7.9.1 方案1 简便可靠的DNA分离与纯化方法 242
7.9.3 方案3 NucleoBond制备的BAC DNA的纯化 244
7.9.2 方案2 利用NucleoBond系统从细菌培养物中分离BAC DNA 244
7.9.4 方案4 酵母DNA凝胶板的大规模制备 245
7.9.5 方案5 利用过滤法纯化YAC DNA 247
7.9.6 方案6 标准大小DNA的注射缓冲液的配制 248
7.9.7 方案7 BAC/YAC DNA注射缓冲液的配制 249
7.9.8 方案8 固定针的制作 249
7.9.9 方案9 注射针的制作 250
7.9.10 方案10 显微操作步骤 251
7.9.11 方案11 小鼠合子的显微注射 253
7.10 常见问题排除指南 256
参考文献 260
第8章 囊胚来源的干细胞系的分离和培养 269
8.1 ES细胞系的获得 271
8.2.1 支原体和小鼠抗体产物的检测 272
8.2 ES细胞的培养 272
8.2.2 ES细胞的培养条件 273
8.2.3 培养基 274
8.2.4 血清 275
8.2.5 白血病抑制因子 276
8.2.6 胰蛋白酶／EDTA 276
8.3 饲养细胞 276
8.3.1 原代小鼠胚胎成纤维细胞 276
8.3.2 STO成纤维细胞 277
8.4 ES细胞染色体的计数 277
8.7.1 方案1 小鼠胚胎成纤维细胞的制备 278
8.7 实验方案 278
8.6 滋胚层干细胞 278
8.5 ES细胞在体外的分化 278
8.7.2 方案2 由MEF或STO细胞制备饲养层细胞 280
8.7.3 方案3 ES细胞的传代 281
8.7.4 方案4 用冻存管冷冻和解冻ES细胞 282
8.7.5 方案5 用囊胚从头分离ES细胞 283
8.7.6 方案6 ES细胞染色体的计数 288
8.7.7 方案7 ES细胞分化为类胚体 290
8.7.8 方案8 培养TS细胞系 290
8.7.9 方案9 从囊胚分离TS细胞系 292
参考文献 294
第9章 基于胚胎干细胞的转基因和基因组改变的载体设计 297
9.1.2 可筛选标记 299
9.1.1 基因组和基因元件 299
9.1 元件总汇 299
9.1.3 报告基因 301
9.1.4 位点特异重组酶 301
9.1.5 可诱导系统 303
9.1.6 检测重组酶的报告子 303
9.2 ES细胞介导的转基因 303
9.3 基因打靶 305
9.4 基因和启动子诱捕 308
9.5 同源重组——置换 310
9.6 位点特异性重组介导的插入 311
9.7 可诱导位点特异染色体变异 313
9.8 产生纯合突变的ES细胞系 314
9.9 实验方案（体外筛选以在小鼠中获得普遍性转基因表达） 315
参考文献 317
第10章 向胚胎干细胞中导入外源DNA 323
10.1 一般注意事项 325
10.2 向ES细胞基因组中导入的DNA的纯化 325
10.3 DNA导入ES细胞的电转化以及筛选方法 325
10.4 ES细胞克隆的挑取、平板传代以及冻存ES细胞系用于基因型分析 325
10.5 用培养于96孔组织培养板中的细胞快速准备DNA 326
10.6 实验方案 327
10.6.1 方案1 通过电转化向ES细胞中导入DNA以及筛选方法 327
10.6.2 方案2 通过挑取的方法分离单个ES细胞克隆 329
10.6.3 方案3 在96孔组织培养板中冻存ES细胞 330
10.6.4 方案4 在96孔组织培养板中解冻ES细胞 331
10.6.5 方案5 用培养于96孔组织培养板中的细胞快速准备DNA 332
10.6.6 方案6 用培养于24孔组织培养板中的细胞准备DNA 333
10.6.7 方案7 挑取克隆前对ES细胞克隆进行基因型分析 334
参考文献 336
第11章 嵌合体的制作 337
11.1 总论 339
11.2 嵌合体的类型 341
11.2.1 二倍体胚胎-二倍体胚胎聚集的嵌合体 341
11.2.2 ES细胞-二倍体胚胎聚集和注射的嵌合体 342
11.2.3 二倍体胚胎-四倍体胚胎聚集的嵌合体 342
11.2.4 ES细胞-四倍体胚胎凝集和注射的嵌合体 343
11.3 ES细胞注射嵌合体的产生 344
11.3.1 注射用囊胚的准备 344
11.3.3 注射针和固定针的制备 345
11.3.2 注射用ES细胞的准备 345
11.3.4 ES细胞注射针针尖的制备 346
11.3.5 显微注射仪的组装 346
11.4 聚集嵌合体的制作 347
11.5 嵌合囊胚的移植 347
11.6 用ES细胞注射或聚集法所产生的嵌合小鼠的饲养 347
11.7 实验方案 348
11.7.1 方案1 注射用ES细胞的制备 348
11.7.2 方案2 Sutter拉针仪P-97型有用参数的确定 349
11.7.3 方案3 ES细胞注射针尖的折断 350
11.7.4 方案4 显微注射仪的组装 351
11.7.5 方案5 囊胚注射 352
11.7.6 方案6 制备凝集用的ES细胞 355
11.7.7 方案7 制备凝集板 356
11.7.8 方案8 去透明带 357
11.7.9 方案9 四倍体胚胎的产生 358
11.7.10 二倍体胚胎之间的聚集 360
11.7.11 方案11 把卵裂期的胚胎和囊胚期的内细胞团细胞分散成单个细胞 364
11.7.12 方案12 免疫外科手术分离囊胚的内细胞团 365
参考文献 368
第12章 小鼠基因组变化及其特定序列的检测和分析 371
12.1 动物的标记 373
12.2 用于检测基因型或转基因特征的组织样品和DNA制备 374
12.3 检测和分析原核注射产生的转基因 375
12.4 检测和分析ES细胞介导的基因／基因组改变 376
12.5 小鼠染色体和核型 377
12.6 转基因表达分析 377
12.8 鉴别纯合转基因小鼠或胚胎 379
12.7 克隆转基因-宿主DNA连接 379
12.8.1 量化转基因剂量 380
12.8.2 量化转基因产物或表型 380
12.8.3 间期核的原位杂交 380
12.8.4 后代检测 380
12.8.5 用搭界探针进行Southern印迹分析 381
12.8.6 用搭界引物进行PCR分析 381
12.9 实验方案 381
12.9.1 方案1 从小鼠尾尖中提取高分子量DNA 381
12.9.2 方案2 从胚胎组织、卵黄囊和脐带等提取高分子量DNA 382
12.9.3 方案3 用于制备PCR模板的组织裂解 383
12.9.4 方案4 聚合酶链式反应 386
12.9.5 方案5 从ES细胞或其他培养细胞中制备Southern杂交用或PCR用DNA 387
12.9.6 方案6 小鼠细胞核型分析 388
参考文献 390
第13章 小鼠孤雌生殖、原核移植和克隆 393
13.1 孤雌胚的制作 395
13.2 原核移植 395
13.3 小鼠克隆 395
13.4 实验方案 396
13.4.1 方案1 乙醇诱导的卵母细胞孤雌激活 396
13.4.2 方案2 小鼠胚胎的原核移植 396
13.4.3 方案3 小鼠克隆 402
参考文献 409
第14章 辅助生殖——卵巢移植、体外受精、人工授精和胞质内精子注射 411
14.1.1 雌性不育 413
14.1 不育 413
14.1.2 雄性不育 414
14.2 挽救小鼠生殖功能的策略 414
14.2.1 卵巢移植 414
14.2.2 体外受精 415
14.2.3 人工授精 418
14.2.4 胞质内精子注射 418
14.3 实验方案 419
14.3.1 方案1 卵巢移植 419
14.3.2 方案2 体外受精 420
14.3.3 方案3 非手术法人工授精 422
14.3.4 方案4 手术法人工授精 424
14.3.5 方案5 胞质内单精子注射 425
参考文献 432
第15章 小鼠胚胎的冷冻、解冻及运输 435
15.1 胚胎冷冻 437
15.1.1 平衡冷冻法 437
15.1.2 非平衡冷冻法 437
15.1.3 胚胎冷冻中应考虑的因素 438
15.2 精子冷冻保存 438
15.3 卵巢冷冻保存 439
15.4 储藏和记录 439
15.5 小鼠品系的恢复 440
15.6 小鼠胚胎的运输 441
15.7 实验方案 441
15.7.1 方案1 胚胎慢速冷冻法 441
15.7.2 方案2 胚胎快速冷冻法 443
15.7.3 方案3 精子冷冻 447
15.7.4 方案4 卵巢冷冻 449
15.7.5 方案5 胎的包装和运输 450
参考文献 451
第16章 基因表达产物、细胞、组织及器官系统的观察技术 457
16.1 基因表达产物的观察 459
16.1.1 提取鼠胚胎或胎儿组织中的总RNA 459
16.1.2 电泳分析嵌合组织中的磷酸葡萄糖异构酶同工酶 459
16.1.3 普通免疫组化和原位杂交技术用于分析鼠胚胎部分组织 459
16.1.4 胚胎切片免疫组化 460
16.1.5 全胚免疫组化 460
16.1.6 胚胎和组织切片的RNA探针原位杂交 460
16.1.7 全胚的RNA探针原位杂交 461
16.1.8 β-半乳糖苷酶活性染色 462
16.2 细胞观察（荧光蛋白观察） 463
16.1.9 碱性磷酸酶活性染色 463
16.3.1 组化染色观察小鼠骨骼 465
16.3.2 印度黑染色液注射观察胎儿血管系统 465
16.3 组织和器官系统的观察 465
16.3.3 塑形术观察胎儿大血管 467
16.4 实验方案 467
16.4.1 方案1 提取小鼠胚胎或胎儿组织中的总RNA 467
16.4.2 方案2 电泳分析嵌合组织中的磷酸葡萄糖异构酶同工酶 469
16.4.3 方案3 组织固定液的准备 471
16.4.4 方案4 处理囊胚用于固定 472
16.4.5 方案5 石蜡包埋 472
16.4.6 方案6 切片 474
16.4.7 方案7 准备载玻片和盖玻片用于原位杂交 475
16.4.9 方案9 胚胎切片免疫组化 477
16.4.8 方案8 切片去石蜡和再水化用于原位杂交或染色 477
16.4.10 方案10 全胚免疫组化 479
16.4.11 方案11 胚胎和组织切片的RNA探针原位杂交 482
16.4.12 方案12 全胚RNA探针原位杂交 487
16.4.13 方案13 全胚原位杂交后胚胎成像 491
16.4.14 方案14 全胚原位杂交后胚胎切片 491
16.4.15 方案15 β-半乳糖苷酶（lacZ）活性染色 493
16.4.16 方案16 碱性磷酸酶活性染色 496
16.4.17 方案17 着床后全胚绿色荧光蛋白（GFP）表达的观察 496
16.4.18 方案18 活细胞GFP融合蛋白观察 497
16.4.19 方案19 固定细胞内GFP的观察 497
16.4.20 方案20 固定和石蜡包埋用于GFP观察 498
16.4.22 方案22 Alcian蓝／茜素红（alizarine）染软骨和骨组织 499
16.4.21 方案21 Alcian蓝染胎儿软骨组织 499
16.4.23 方案23 出生后胎儿骨组织的茜素红染色 500
16.4.24 方案24 注射印度黑染液观察胎儿血管系统 501
16.4.25 方案25 塑形术（plasticcasting）观察胎儿大血管 502
参考文献 502
第17章 显微操作实验室的建立 505
17.1 小鼠、饲养管理和标记系统 507
17.1.1 近交系、远交系、杂交系和遗传修饰小鼠 507
17.1.2 笼具、饲养管理和标记 507
17.2 显微操作实验室及其环境 508
17.2.1 总则 508
17.2.2 显微注射实验室的常用仪器 508
17.2.3 体视显微镜及其有关设备 510
17.2.4 显微操作设备 512
17.2.5 电融合和聚合 513
17.2.6 用玻璃毛细管制作显微操作工具 513
17.2.7 精细仪器和工具 514
17.2.8 耗材和塑料器皿 515
17.2.9 冷冻保存 515
17.3 信息资源 515
17.4 声明 517
附录1 缓冲液和溶液 519
参考文献 526
附录2 注意事项 527
附录3 供应商 536
索引 537