第1章 绪论 1
第2章 基因的概念及其发展 10
2.1 基因组的表观差异 10
2.1.1 原核和真核基因组的比较 10
2.1.2 DNA的重复序列 10
2.1.3 卫星DNA(s-DNA) 12
2.1.4 DNA插入顺序 12
2.1.5 内含子 12
2.1.6 DNA的非编码序列 14
2.1.7 基因组中的非表达基因 14
2.1.8 功能上相似的基因族 15
2.2 基因特性的理解 15
2.4 基因的现代概念 17
2.3 原核和真核基因的类型 17
2.4.1 可移动基因 18
2.4.2 断裂基因 19
2.4.3 重叠基因 20
2.4.4 假基因 21
2.4.5 反转子及反转录基因 22
第3章 基因工程的工具酶 31
3.1 限制性核酸内切酶 31
3.1.1 限制性核酸内切酶的发现和生物功能 31
3.1.2 Ⅰ型和Ⅲ型限制性核酸内切酶 33
3.1.3 Ⅱ型限制性核酸内切酶 34
3.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 48
3.3 T4DNA聚合酶 49
3.4 T4DNA连接酶 50
3.5 逆转录酶 51
3.6 核酸酶SI 52
3.7 末端脱氧核苷酸转移酶 53
3.8 脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ) 53
3.9 外核酸酶Ⅲ 54
3.10 外核酸酶Bal31 54
3.11 T4多核苷酸激酶 55
3.12 碱性磷酸化酶 57
第4章 基因工程的载体 58
4.1 质粒 58
4.1.1 质粒的一般性质和研究意义 58
4.1.2 质粒的研究历史 60
4.1.3 质粒的类型 60
4.1.4 大肠杆菌质粒载体 61
4.1.6 农杆菌T1质粒载体 69
4.1.5 枯草杆菌质粒载体 69
4.1.7 质粒的复制 73
4.2 细菌噬菌体λ 79
4.2.1 噬菌体λ的一般性质 79
4.2.2 λ噬菌体载体 82
4.2.3 噬菌体λ重组DNA分子的体外包装 85
4.3 Cosmid(科斯质粒) 85
4.4 单链DNA噬菌体M13 88
4.5 Phagemid载体系列 91
4.6 酵母质粒载体 94
4.7 人和动物病毒载体 95
4.7.1 猴病毒40（SV40） 96
4.7.2 牛乳头瘤病毒（BPV） 98
4.7.3 RNA肿瘤病毒 99
4.7.4 腺病毒（ADV） 101
4.7.6 痘苗病毒（VCV） 102
4.7.5 单纯疱疹病毒（HSV） 102
4.8 植物病毒载体 103
第5章 杆状病毒载体及其表达系统 105
5.1 杆状病毒的生物学 105
5.1.1 杆状病毒的分类与基本结构 105
5.1.2 杆状病毒的生活史 105
5.1.3 杆状病毒的体外复制系统 107
5.2 杆状病毒的分子生物学 107
5.2.1 杆状病毒的基因组结构 107
5.2.2 杆状病毒的基因概述 107
5.3 杆状病毒基因的表达与调控 111
5.3.2 早期基因的启动子结构 112
5.3.3 迟晚期基因启动子及高效表达调控机制 112
5.3.1 极早期基因的反式调控 112
5.3.4 杆状病毒增强子的顺式调控 113
5.3.5 杆状病毒重叠RNA的调控 113
5.4 杆状病毒表达系统评价 114
5.4.1 杆状病毒表达系统的优越性 114
5.4.2 杆状病毒表达系统的缺点 115
5.4.3 影响靶基因在昆虫细胞中表达的因素 116
5.5 杆状病毒克隆表达的经典策略 116
5.6 杆状病毒载体 116
5.6.1 多角体基因转移载体 118
5.6.2 p10基因转移载体 122
5.6.3 其它基因构建的转移载体 126
5.6.4 双基因转移载体 129
5.6.5 多基因转移载体 133
5.6.6 以绿色荧光蛋白基因作标记构建的转移载体 133
5.7.1 β-半乳糖苷酶基因(β.galactosidase gene,简称LacZ) 137
5.7 杆状病毒表达系统中阳性重组病毒的筛选 137
5.7.2 斑点杂交和原位杂交 138
5.7.3 PCR技术 139
5.7.4 胸腺核苷激酶基因（thymldine kinase gene, 简称tk） 139
5.7.5 新霉素抗性基因（neomycin resistance gene,简称neo） 140
5.7.6 细胞凋亡抑制基因（p35 基因） 143
5.8 杆状病毒克隆表达的新策略 144
5.8.1 高频重组策略(线型化技术) 144
5.8.2 转座子介导的重组策略(Bac to Bac系统) 145
5.8.3 体外酶促定位重组策略 152
5.8.4 酵母YAC介导的重组策略 152
第6章 放射性同位素和DNA的标记 155
6.1 放射性同位素的基本知识 155
6.2 放射性同位素的衰变 156
6.2.1 放射性同位素的衰变类型 156
6.2.2 分子生物学中常用的放射性同位素 157
6.3 放射性同位素的衰变定律 158
6.4 放射性的探测与测量 159
6.4.1 盖革计数管(Geiger counter tuber) 159
6.4.2 闪烁计数器 161
6.4.3 放射自显像 164
6.5 DNA的放射性同位素标记 165
6.5.1 外切法标记DNA的3′平头末端 165
6.5.2 填充法(fill-in)标记DNA的3′平头末端 166
6.5.3 外切法标记DNA3′不等末端(recessed end) 167
6.5.4 末端转移法标记dsDNA的3′末端 167
6.5.5 dsDNA的5′-磷酸末端标记 167
6.5.6 dsDNA的5′-OH末端标记 168
6.5.7 限制性消化法制备探针 168
6.5.8 缺刻转移法制备探针 169
6.5.9 随机引物标记法制备探针 169
6.5.10 DNA全链的逆转录酶标记法 170
6.5.11 DNA大片段的链终止法标记 171
6.5.12 RNA标记 171
6.6 放射性同位素实验室的安全及防护 171
第7章 DNA的物理图谱 173
7.1 概述 173
7.2 部分消化法 174
7.3 双酶消化法 176
7.4 顺序消化法 179
7.5 交叉消化法 181
7.6 末端标记法 181
7.7 内切外切混合消化法 181
7.8 分子杂交法 185
7.9 Southern十字杂交法 188
7.10 组建DNA物理图谱的三三规则 189
第8章 分子杂交 195
8.1 分子杂交的原理 195
8.2 Soutbern blot 198
8.2.1 DNA片段的转移 198
8.2.2 Southern薄膜杂交 199
8.3 凝胶薄膜杂交 200
8.3.1 凝胶薄膜的制备 200
8.3.2 杂交 201
8.4 原位杂交(Hybridization in situ) 201
8.4.1 菌落生长 202
8.4.2 DNA的释放与固定 202
8.4.3 杂交 202
8.5 斑点杂交(Dot blot) 203
8.6 Northern blot 203
8.7 Western blot 204
8.8 Southern十字吸附杂交法(Cross blot) 205
第9章 DNA的序列测定 210
9.1 引言 210
9.2 DNA序列测定的ddNTP链终止法 211
9.2.1 ddNTP链终止法原理 211
9.2.2 DNA链终止法测定系统 212
9.2.3 DNA大片段序列的测定战略 232
9.3 DNA序列测定的 加减法 240
9.3.1 DNA的不同步合成 240
9.3.2 “减”系统 241
9.3.3 “加”系统 241
9.4 DNA序列测定的化学直读法 242
9.5 DNA序列的激光测定法 244
10.1 PCR原理 247
第10章 多聚酶链反应(PCR) 247
10.2 PCR的扩增过程 249
10.2.1 用于PCR扩增的Taq DNA聚合酶 249
10.2.2 用于PCR扩增的引物 250
10.2.3 用于PCR扩增的dNTP 252
10.2.4 PCR缓冲液中的Mg2+ 浓度 253
10.2.5 DNA样品 253
10.2.6 矿物油 253
10.2.7 循环次数 253
10.2.8 PCR反应的温度和时间 254
10.2.9 扩增产物的大小和结构 255
10.3 PCR的类型 256
10.3.1 套组PCR(Nested PCR) 256
10.3.2 表达PCR(Expession PCR) 258
10.3.3 锅柄PCR(Panhandl PCR) 260
10.3.4 行军PCR(Walking PCR) 261
10.3.6 不对称PCR(Asymmetric PCR) 262
10.3.5 反向PCR(Inverse PCR) 262
10.3.7 序列PCR(Sequencing PCR) 263
10.3.8 等位特异性PCR（Allele-Specific Amplification,ASA） 263
10.3.9 Alu PCR 264
10.3.10 差异PCR(Differential PCR) 264
10.4 超长DNA片段的PCR扩增 264
10.4.1 扩增超长DNA片段的要点 265
10.4.2 扩增超长DNA片段的PCR策略 267
10.5 反转录PCR(RT- PCR) 270
10.5.1 连续RT- PCR(两阶段单管式) 270
10.5.2 长距离RT- PCR(两阶段双管式) 271
10.5.3 一步RT- PCR 272
11.1.1 DNA的提取 274
第11章 分子克隆 274
11.1 基因的分离与合成 274
11.1.2 从原核生物分离纯化目的基因 280
11.1.3 从真核生物分离纯化目的基因 280
11.2 外源基因与载体DNA的连接反应原理 285
11.3 外源基因与载体DNA的连接反应 291
11.3.1 引言 291
11.3.2 连接反应的类型 294
11.3.3 cDNA与载体的连接反应 299
11.4 重组DNA分子导入原核细胞 300
11.4.1 感受态细胞(Competance Cells) 302
11.4.2 转化程序 303
11.4.3 阳性重组菌落的筛选 303
11.5 重组DNA分子导入真核细胞 306
12.1 基因工程的表达系统 309
第12章 外源基因的表达与调控 309
12.2 外源基因在转录起始水平的调控 310
12.2.1 RNA聚合酶(RNA polymrase,反式作用正调控因子) 311
12.2.2 启动子(Promoter,顺式作用正调控元件) 313
12.2.3 基因工程常用启动子 315
12.2.4 操纵元(Operon,顺式作用正调控元件) 319
12.2.5 增强子(Enhancer,顺式作用正调控元件) 321
12.2.6 减弱子(Debancer,顺式作用负调控元件) 322
12.3 外源基因在转录终止水平上的调控 323
12.3.1 终止子(Terminator,顺式作用负调控元件) 323
12.3.2 衰减子(Attenuator,顺式作用负调控元件) 324
12.4 外源基因在转录后的调控 327
12.5 外源基因表达在翻译水平上的调控 327
12.5.1 偶联翻译与非偶联翻译 327
12.5.2 原核mRNA的Shine-Dalgarno序列(SD序列,顺式作用正调控元件) 328
12.5.3 原核钥匙蛋白(Key protein,反式作用负调控因子) 329
12.5.4 真核mRNA的Kozak序列(顺式作用正调控元件) 329
12.5.5 真核mRNA翻译的起始因子(反式作用正调控因子) 330
12.5.6 反意RNA(Antisence RNA,简称at-RNA) 332
12.6 高效表达外源基因的措施 333
12.6.1 最适SD序列 333
12.6.2 融合蛋白的表达及载体阅读框架的修饰 334
12.6.3 减轻缩主细胞的代谢负荷,提高外源基因的表达水平 337
附录 340
一、常用数据和参数 340
二、某些基因组DNA的限制片段和大小（bp） 348
三、遗传密码 351
四、常用培养基和抗菌素 352
五、常用溶液和缓冲液 355
参考文献 360