第一章 电泳概论 1
1.1 电泳的早期历史 2
1.2 电泳的简单原理 6
1.3 电泳的大致分类 8
1.4 凝胶电泳技术的历史 9
参考文献 10
第二章 凝胶电泳的支持介质 14
2.1 聚丙烯酰胺凝胶的形成和结构 15
2.2 丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的纯化和毒性 18
2.3 引发剂、增速剂和聚合 20
2.4 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径和分子筛效应 23
2.5 琼脂糖凝胶的性能、结构与特点 25
2.6 电泳新介质 32
参考文献 35
第三章 凝胶电泳仪器的进展 38
3.1 电泳槽 38
3.1.1 圆盘电泳 39
3.1.2 垂直电泳 41
3.1.3 水平电泳 43
3.1.4 水平平板电泳的优点 44
3.2 电源 46
3.4 凝胶干燥器 47
3.3 外循环恒温系统 47
3.6 电泳转移 48
3.5 各种灌胶模具 48
3.7 电泳洗脱仪 50
3.8 制备电泳仪 50
3.9 凝胶扫描和摄录装置 52
参考文献 53
第四章 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 54
4.1 原理 54
4.1.1 蛋白质的电泳行动 54
4.1.2 原理 55
4.1.3.1 pH的选择 57
4.1.3 缓冲系统的选择 57
4.1.3.2 离子强度的选择 59
4.1.4 凝胶浓度的选择 61
4.1.4.1 浓缩胶与分离胶 62
4.1.4.2 浓缩胶的作用原理 63
4.1.4.3 均一胶和梯度胶 64
4.1.5 连续电泳和不连续电泳 64
4.1.6 分子量测定 66
4.2 方法 69
4.2.1.1 垂直平板电泳的制胶 70
4.2.1 制胶 70
4.2.1.2 水平平板电泳的制胶 73
4.2.2 样品的准备 79
4.2.2.1 选择合适的样品缓冲液 79
4.2.2.2 蛋白标准的准备 79
4.2.2.3 样品浓度 79
4.2.2.4 加样要求 80
4.2.3 电泳 80
4.2.3.1 垂直电泳 80
4.2.3.2 水平电泳 81
4.2.4.1 早期染色方法 82
4.2.4 检测 82
4.2.4.2 考玛斯亮蓝染色 83
4.2.4.3 银染色 87
4.2.4.4 其他染色方法 91
4.2.4.5 一些蛋白的染色方法 92
4.2.4.6 同工酶染色 95
4.2.4.7 荧光探针法 100
4.2.4.8 免疫方法 102
4.2.4.9 电泳转移 103
4.2.4.10 电泳后蛋白带的氨基酸分析 103
4.2.5 照相,凝胶干燥 104
4.2.6 定量测定 105
4.3 实验考虑 106
4.3.1 电泳方法和方式的选择 106
4.3.2 最佳凝胶浓度和缓冲系统的选择 106
4.3.3 凝胶聚合不佳的原因和对策 107
4.3.4 样品的预处理 108
4.3.5 阳极电泳和阴极电泳 108
4.3.6 半干技术 109
4.3.7 检测方法和选择 111
4.3.8 电泳过程中的不正常现象和对策 112
4.3.9 电泳结果的分析 113
参考文献 115
第五章 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 123
5.1 原理 123
5.1.1 蛋白质分子的解聚 123
5.1.2 缓冲系统的选择 126
5.1.3 凝胶浓度的选择 127
5.1.4 分子量测定 128
5.1.4.1 分子量测定的理论背景 128
5.1.4.2 蛋白标准 129
5.1.4.3 分子量的计算 130
5.1.5 低分子量多肽的SDS电泳 131
5.2.1 制胶(用于垂直电泳或水平电泳) 132
5.2 方法 132
5.2.2 样品的准备 137
5.2.2.1 样品缓冲液的配制 137
5.2.2.2 蛋白标准的准备 138
5.2.2.3 样品浓度和加样要求 138
5.2.3 电泳 138
5.2.3.1 垂直电泳 138
5.2.3.2 水平电泳 138
5.2.4 检测 139
5.2.4.1 考玛斯亮蓝染色 140
5.2.4.2 银染色 141
5.2.4.3 其他染色方法 144
5.2.4.4 荧光探针法 145
5.2.4.5 电泳转移 145
5.2.4.6 电泳后蛋白带的氨基酸组成和序列分析 145
5.2.4.7 电泳后的肽图分析 145
5.2.5 照相,凝胶干燥 146
5.2.6 定量测定 146
5.3 实验考虑 146
5.3.1 SDS电泳是测定蛋白质亚基分子量的最佳选择 146
5.3.2 凝胶浓度和缓冲系统的选择 147
5.3.3 SDS-琼脂糖凝胶电泳 148
5.3.4.1 阳离子去污剂 149
5.3.4 去污剂的选择 149
5.3.4.2 无离子去污剂 150
5.3.4.3 酸-尿素去污剂 150
5.3.4.4 电荷位移电泳 150
5.3.5 样品的处理 151
5.3.5.1 还原SDS处理 151
5.3.5.2 带有烷基化作用(alkylation)的还原SDS处理 152
5.3.5.3 非还原的SDS处理 152
5.3.6 半干技术 153
5.3.7 检测方法的选择 154
5.3.8 生物活性的恢复 154
5.3.8.1 在凝胶中恢复活性 155
5.3.8.2 电泳转移后恢复生物活性 156
5.3.8.3 洗脱后在自由溶液中恢复生物活性 156
5.3.9 电泳过程中的不正常现象和对策 156
5.3.10 电泳结果的分析 156
参考文献 157
第六章 载体两性电解质pH梯度等电聚焦 161
6.1 原理 161
6.1.1 蛋白质的等电点 161
6.1.2 等电聚焦—在pH梯度中的电泳 162
6.1.3 等电聚焦的分辨率 164
6.2.1 历史 166
6.2 载体两性电解质和pH梯度的形成 166
6.2.2.1 Ampholine的合成(瑞典LKB公司) 167
6.2.2 合成 167
6.2.2.2 Servalyte的合成(德国Serva公司) 168
6.2.2.3 Pharmalyte的合成(瑞典Pharmacia公司) 169
6.2.2.4 实验室合成 170
6.2.2.5 中国军事医学科学院的载体两性电解质 170
6.2.3 特性 170
6.2.3.1 分子量小 170
6.2.3.2 可溶性好 171
6.2.3.5 紫外吸收低,不发荧光 172
6.2.3.3 缓冲能力强 172
6.2.3.4 导电性均匀 172
6.2.3.6 容易从聚焦的蛋白带中除去 173
6.2.3.7 无毒、无生物学效应 173
6.2.3.8 螯合性质 173
6.2.4 pH梯度的形成 173
6.3 薄层分析等电聚焦的方法 175
6.3.1 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 175
6.3.1.1 制胶 175
6.3.1.2 等电聚焦 179
6.3.1.4 固定、染色、脱色 180
6.3.1.3 pH梯度测定 180
6.3.1.5 保存 181
6.3.2 琼脂糖凝胶等电聚焦 181
6.3.2.1 制胶 181
6.3.2.2 等电聚焦 183
6.3.2.3 pH梯度的测定 183
6.3.2.4 固定,染色,脱色,保存 184
6.4 实验考虑 184
6.4.1 稳定介质的选择 184
6.4.2 稳定介质的电内渗 185
6.4.3 载体两性电解质和pH梯度范围的选择 187
6.4.4 丙烯酰胺的聚合 189
6.4.5 电极溶液 191
6.4.6 四甲基乙二胺(TEMED)对丙烯酰胺凝胶的聚合和pH梯度的影响 192
6.4.7 样品的预处理 194
6.4.8 加样方法 196
6.4.9 电参数(电压,电流,功率,温度和时间) 197
6.4.10 pH梯度和pI的测定 201
6.4.11 聚焦后的检测 202
6.4.11.1 各种染色方法 202
6.4.11.2 扫描与定量 203
6.4.12.1 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 204
6.4.12 聚焦过程中出现的问题及解决方法 204
6.4.11.5 滴定曲线 204
6.4.11.4 双向电泳 204
6.4.11.3 电泳转移 204
6.4.12.2 琼脂糖凝胶等电聚焦 208
参考文献 210
第七章 固相pH梯度等电聚焦 214
7.1 原理 214
7.1.1 固相pH梯度介质的结构和合成 214
7.1.2 Immobiline的物化特性 219
7.1.3 固相pH梯度的原理 223
7.1.3.1 Henderson-Hasselbalch公式 223
7.1.3.2 一个pH范围的固相pH梯度 224
7.1.3.3 窄范围和宽范围的pH梯度 226
7.1.3.4 固相pH梯度的计算机模拟 233
7.1.4 分辨率 234
7.2 方法 238
7.2.1 制胶 238
7.2.1.1 选择pH范围:计算缓冲与滴定Immobiline的体积 238
7.2.1.2 贮液配置 239
7.2.1.3 模具组装和凝胶溶液的配制 239
7.2.1.4 灌胶 240
7.2.1.5 洗胶和吹胶 240
7.2.2 等电聚焦 241
7.2.4.1 各种染色方法 242
7.2.3 pH梯度的测定 242
7.2.4 检测 242
7.2.4.2 凝胶干燥与保存 243
7.2.4.3 扫描与定量 243
7.2.4.4 双向电泳 243
7.2.4.5 电泳转移 243
7.3 实验考虑 243
7.3.1 固相pH 梯度的优缺点 243
7.3.2 pH范围的选择 245
7.3.3 灌胶与聚合 245
7.3.4 洗胶与干胶 246
7.3.5 离子强度、缓冲能力和导电性 247
7.3.6 电内渗 248
7.3.7 蛋白质的可溶性和添加剂 249
7.3.8 盐对固相pH梯度等电聚焦的影响 251
7.3.9 电参数 252
7.3.10 等电点的实验测定 253
7.3.11 与质谱连用 254
7.3.12 电泳过程中出现的问题和解决方法 254
7.4 等电聚焦技术的进展 255
7.4.1 第一代等电聚焦 255
7.4.3 第三代等电聚焦 256
7.4.2 第二代等电聚焦 256
7.4.4 第四代等电聚焦 257
参考文献 258
第八章 双向电泳 262
8.1 概述 262
8.1.1 O＇Farrell系统—ISO-DALT系统 263
8.1.2 IPG-DALT系统 264
8.2 方法 265
8.2.1 ISO-DALT方法 265
8.2.1.1 等电聚焦凝胶的准备 265
8.2.1.4 pH梯度的测定 266
8.2.1.2 样品的准备和加样 266
8.2.1.3 等电聚焦 266
8.2.1.5 平衡 267
8.2.1.6 SDS凝胶的准备 267
8.2.1.7 二向间的转移 267
8.2.1.8 SDS电泳 267
8.2.1.9 检测 267
8.2.2 IPG-DALT方法 268
8.2.2.1 固相pH梯度凝胶或凝胶条的准备 268
8.2.2.2 溶液配制 268
8.2.2.4 样品准备和加样 269
8.2.2.3 凝胶的重新水化 269
8.2.2.5 等电聚焦 270
8.2.2.6 pH梯度的测定 270
8.2.2.7 平衡 270
8.2.2.8 SDS凝胶的准备 270
8.2.2.9 二向间的转移 270
8.2.2.10 SDS电泳 271
8.2.2.11 检测 271
8.3 实验考虑 271
8.3.1 双向电泳的次序 271
8.3.2 非平衡pH梯度电泳(NEPHGE) 271
8.3.3 管状、垂直与水平方式的比较 272
8.3.4 ISO-DALT和IPG-DALT 274
8.3.5 样品的处理 275
8.3.6 去污剂的影响 278
8.3.7 聚焦参数 278
8.3.8 IPG-DALT系统第一向电泳时的油层覆盖 279
8.3.9 两向间的平衡和转移 279
8.3.10 双向标准 280
8.3.11 点的延长和扩散 282
8.3.12 纹理现象 282
参考文献 283
9.1 概念 287
第九章 滴定曲线 287
9.2 方法 291
9.3 实验考虑 291
9.3.1 在8mol/L尿素和去污剂中的滴定曲线 291
9.3.2 大分子的滴定曲线 292
9.3.3 用琼脂糖作为支持介质 292
参考文献 292
第十章 免疫电泳 294
10.1 原理 295
10.1.1 免疫电泳基础 295
10.1.2 单免疫扩散-Mancini技术 295
10.1.3 双扩散-Ouchterlony技术 296
10.1.4 Grabar和Williams免疫电泳 298
10.1.5 “火箭”免疫电泳 299
10.1.5.1 Laurell“火箭”免疫电泳 299
10.1.5.2 融合“火箭”免疫电泳 299
10.1.6 交叉免疫电泳 301
10.1.6.1 Clarke 和Frccman交叉免疫电泳 301
10.1.6.2 串联交叉免疫电泳 301
10.1.7 反向免疫电泳 303
10.2 方法 303
10.2.1 溶液的准备 303
10.2.4 电泳 304
10.2.2 倒胶 304
10.2.3 打孔与加样 304
10.2.5 检测 305
10.3 实验考虑 305
10.3.1 支持介质 305
10.3.2 缓冲系统 306
10.3.3 抗体和抗血清 306
10.3.4 方法的选择 307
10.3.5 laying-on 技术 307
10.3.6 媒介凝胶技术 308
10.3.7 免疫沉淀的观察 309
参考文献 310
第十一章 蛋白质印迹 312
11.1 原理 312
11.1.1 几种印迹方法 313
11.1.1.1 点印迹 313
11.1.1.2 扩散印迹 314
11.1.1.3 溶剂流印迹 314
11.1.1.4 电泳印迹 315
11.1.2 固定化材料 317
11.1.2.1 硝化纤维素膜 317
11.1.2.2 尼龙膜 317
11.1.2.3 DBM和DPT纸 318
11.1.3 转移缓冲液 319
11.1.4 封阻,标记和检测 320
11.2 方法 320
11.2.1 从SDS凝胶上转移蛋白 320
11.2.1.1 溶液配置 320
11.2.1.2 转移单元的组成 321
11.2.2.1溶液配置 322
11.2.2.2转移单元的组成 322
11.2.2.3电参数 322
11.2.2 从琼脂糖凝胶上转移蛋白 322
11.2.1.3 电参数 322
11.2.3 从等电聚焦凝胶上转移蛋白 323
11.2.3.1 溶液配置 323
11.2.3.2 转移单元的组成 323
11.2.3.3 电参数 323
11.2.4检测 323
11.3 实验考虑 324
11.3.1 电泳转移的效率 324
11.3.2 转移缓冲液 324
11.3.3 封阻 326
11.3.4 探针 327
11.3.5 总蛋白染色 328
11.3.6.1 溶液和材料 329
11.3.6 转移膜的塑料包埋和透明化 329
11.3.6.2 操作 330
11.3.7 垂直槽式和水平半干式电泳印迹 330
11.3.8 印迹过程中出现的问题及解决办法 331
参考文献 333
第十二章 制备电泳 339
12.1洗脱 339
12.1.1 扩散洗脱 339
12.2.2 连续自由流动电泳 340
12.2.3 空间电泳 340
12.2 连续电泳 340
12.2.1 连续洗脱电泳 340
12.1.2 电泳洗脱 340
12.3 等电聚焦制备电泳 341
12.3.1 液体介质 341
12.3.2 凝胶介质 342
12.3.3 方法 342
12.3.4 实验考虑 345
12.3.5 固相pH梯度制备等电聚焦 346
12.4 样品的均一性 347
参考文献 347