第一章 绪论 1
第一节 前言 1
第二节 蛋白质的分离方法 4
一、蛋白质与小分子性质比较及分离条件差别 4
二、蛋白质常用纯化方法 5
三、纯化方法设计 6
第三节 蛋白质纯化常用仪器和设备 9
一、基本装置 9
二、试剂 10
第四节 蛋白质纯化时应注意的事项 12
参考文献 13
一、原材料来源 15
第一节 原材料选择 15
第二章 粗制品制备 15
二、原材料保存 18
第二节 原材料破碎 20
一、细胞破碎方法 20
二、样品萃取 22
第三节 样品回收 24
第四节 蛋白质溶液处理方法 27
一、浓缩 27
二、除盐与改变缓冲溶液 30
三、沉淀分离 33
第五节 蛋白质沉淀方法 38
一、盐析法 39
二、有机溶剂沉淀 49
三、其它沉淀法 54
参考文献 55
第三章 经典液相柱色谱法 57
第一节 色谱原理及基本装置 57
第二节 凝胶色谱法 63
一、原理 63
二、凝胶种类 65
三、凝胶色谱使用方法 72
四、应用 77
第三节 离子交换色谱法 78
一、基本原理 78
二、离子交换类型 79
三、离子交换使用方法 82
第四节 亲合色谱法 85
一、固相载体选择 87
二、配件选择 87
三、配件与载体之间偶联方法 89
四、使用方法 93
第四章 高效液相色谱法简介 96
第一节 高效液相色谱仪 98
一、贮液装置 99
二、输液泵 99
三、梯度洗脱装置 101
四、色谱柱 104
五、进样器 106
六、检测器 106
八、数据获取和处理系统 107
七、馏分收集器 107
第二节 基本概念 108
一、保留值 108
二、柱效能的标指 111
三、分离效能总指标 115
第三节 HPLC固定相 123
第四节 HPLC流动相 127
一、对流动相的一般要求 127
二、流动相的主要性质 128
参考文献 129
第五章 高效反相液相色谱 131
第一节 作用机理 132
一、疏溶剂化理论 132
二、双保留机理 137
三、计量置换模型 141
第二节 固定相 143
一、硅胶键合相填料 145
二、硅胶或其它无机物涂层填料 156
三、有机高分子基质填料 157
四、非多孔填料 159
第三节 流动相 159
一、流动相组成及选择条件 160
二、影响分离条件的因素 161
第四节 应用 169
一、HPRPC在其它分离方法无效时却非常有效 169
二、基因重组入IL—2的纯化 170
三、基因重组入α—IFN及人血白细胞α—IFN纯化 171
四、蛋白质的氨基酸组成测定 172
五、酶活性测定 173
六、胰岛素的纯化 174
参考文献 174
第六章 高效离子交换液相色谱 178
第一节 保留机理 178
一、静电作用模型 178
二、计量置换模型 180
三、实际情况中的静电作用机理 182
第二节 固定相 192
一、硅胶基质的离子交换剂 193
二、树脂型填料 199
三、非多孔填料 201
一、取代离子对分离的影响 204
第三节 流动相 204
二、pH值 206
三、梯度洗脱方式 208
四、柱长 209
五、温度 210
六、添加剂 211
第四节 应用 211
四、填料对蛋白质分离影响 212
一、肿瘤坏死因子 212
二、膜蛋白 213
三、血红蛋白 213
四、单克隆抗体 214
五、TGF—α—β—半乳糖苷酶 215
六、HPIEC同HPRPC一样，当别的方法无效时，HPIEC往往很有效 216
参考文献 217
第七章 高效疏水作用液相色谱 220
第一节 保留机理 221
一、疏液剂化理论 222
二、熵增原理 223
三、多价吸附作用机理 223
四、优先水化作用机理 224
五、其它 225
六、计量置换模型 226
第二节 填料 230
一、基质 230
二、配体 231
三、填料 231
一、离子强度 239
第三节 影响分离因素 239
二、盐 240
三、添加剂 241
四、固定相的疏水性 242
五、pH值 242
六、温度 242
七、填料孔径 243
第四节 蛋白质在HPHIC与HPIEC和HPRPC保留行为比较 243
一、蛋白质在HPHIC和HPIEC保留行为的比较 243
二、蛋白质在HPHIC和HPRPC上保留行为比较 246
第五节 应用 251
一、α—IFN 252
二、γ—IFN 252
五、其它蛋白质分离 254
三、单克隆抗体 254
四、IL—2 254
结束语与展望 255
参考文献 256
第八章 高效亲合液相色谱 261
第一节 作用机理 263
一、溶质保留机理 263
二、竞争洗脱保留模型 266
第二节 固定相合成 268
一、载体 269
二、配体 270
三、空间臂 274
四、填料的制备 275
一、特异性洗脱方法的选择 283
第三节 洗脱过程 283
二、非选择性洗脱 285
三、配体与蛋白质作用与它们结合常数间关系 288
第四节 应用 288
一、纯化蛋白质 289
二、临床方面的应用 289
三、通用性配体的应用 289
四、特异性亲合配体的应用 291
参考文献 291
第九章 高效排阻液相色谱 302
第一节 分离原理 304
一、理论保留模型 304
二、模型偏差原因 306
第二节 固定相合成及对分离影响 309
一、硅胶基质填料 309
二、聚合物填料 314
三、柱填料对分离的影响 317
第三节 流动相 319
一、流动相的组成 319
二、影响蛋白质分离的因素 321
三、应用 322
参考文献 325
第十章 高效制备液相色谱 328
第一节 分离条件选择依据 329
一、负载量 330
二、分离效果的评价 331
第二节 最佳化分离条件的建立 332
一、装柱技术 332
二、产品中的污染物 335
三、进样 336
四、检测器 337
五、最佳化分离条件 337
六、样品的负载与回收率纯度间的关系 340
七、制备HPLC的应用 341
参考文献 343
第十一章 其它纯化技术及其与纯化相关的方法 345
第一节 蛋白质结晶 345
一、制备结晶的方法 346
二、影响结晶的因素 347
第二节 双水相体系的蛋白质分离 348
一、基本原理 349
二、影响双水相分配平衡的因素 350
三、实际应用 352
第三节 融合蛋白亲合分离技术 355
一、纯化标签选择 356
二、纯化标签与配体结合特异性 356
三、全属螯合纯化标签 358
第四节 径向色谱 358
第五节 电泳技术 361
一、基本原理 362
二、连续及不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 363
三、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 365
四、等电聚焦电泳 367
六、免疫电泳 369
五、双向电泳 369
七、电泳分离后样品的回收 370
第六节 蛋白质定量和纯度鉴定方法 371
一、定量测定方法 372
二、纯度标准 384
第七节 选择蛋白质纯化路线的基本途径 387
一、确定要解决的问题 390
二、方法的选择 391
三、样品的制备 393
四、专家系统 393
五、最佳分离条件的建立 394
六、分离路线的多样性 396
参考文献 396