1 光学显微镜基础 1
1.1 简介 1
1.2 复式显微镜的关键部件 2
1.2.1 镜体和镜灯 2
1.2.2 聚光镜 3
1.2.3 载物台和聚焦机制 3
1.2.4 物镜 3
1.2.5 目镜 4
1.3 显微镜使用技术 4
1.3.1 明视野显微镜术 4
实验方案1.1 明视野显微镜的调节 4
实验方案1.2 调定柯勒照明 5
1.3.2 油镜的使用 5
实验方案1.3 调焦步骤 5
1.3.3 相差显微镜术 6
实验方案1.4 相差显微镜的调节 6
1.3.4 微分干涉对比显微镜术 7
1.3.5 暗视野显微镜术 7
1.3.6 荧光显微镜术 7
实验方案1.5 调定落射荧光显微镜 8
1.3.7 共聚焦显微镜术 8
1.3.8 常见问题及显微镜保养和维修 9
1.4 样本的准备和染色 10
1.4.1 附着 10
实验方案1.6 多聚L-赖氨酸包被 10
1.4.2 固定 10
1.4.3 准备组织切片 11
1.4.4 染色 11
参考文献 11
2 电子显微镜基础 12
2.1 简介 12
2.2 可用的电子显微镜方法 12
2.2.1 负染色法 12
2.2.2 玻璃化技术 13
2.2.3 金属投影和冰冻断裂技术 13
2.2.4 免疫标记 13
2.2.5 专门技术 13
2.2.6 设备与试剂的危险性 14
实验方案2.1 聚乙烯醇缩甲醛-碳、连续碳和多孔碳支持膜的制备 14
实验方案2.2 “微滴”负染色步骤（使用连续碳、聚乙烯醇缩甲醛-碳及多孔碳支持膜） 15
实验方案2.3 免疫负染法 16
实验方案2.4 负染色-碳膜技术：细胞及细胞器的分裂 17
实验方案2.5 未染色及负染色的玻璃化样本制备 18
实验方案2.6 生物样品的金属投影技术 19
实验方案2.7 组织加工及树脂包埋的常规实验方案 20
实验方案2.8 对细胞及细胞器悬液的琼脂糖胶囊化 21
实验方案2.9 电镜超薄切片的常规染色 22
实验方案2.10 包埋后薄切片的间接免疫标记 23
实验方案2.11 使用免包埋电子显微镜技术显示核基质和细胞骨架 24
致射 28
参考文献 29
3 细胞培养 30
3.1 细胞：分离和分析 30
3.2 机械法分离组织 31
实验方案3.1 机械剪切作用使组织解聚 31
实验方案3.2 使用温热的胰蛋白酶使组织解聚 32
实验方案3.3 冷胰蛋白酶消化 34
实验方案3.4 应用胶原酶或中性蛋白酶解聚 35
3.3 从体液中分离细胞 36
实验方案3.5 从渗出液中回收细胞 36
3.4 去除红细胞 37
实验方案3.6 急速裂解法去除红细胞 37
实验方案3.7 等密度离心法去除红细胞和死细胞 38
3.5 细胞计数和细胞活力 38
实验方案3.8 细胞计数和活力测定 39
3.6 细胞培养的用途 41
实验方案3.9 从单层培养物回收细胞 41
3.7 冷藏 42
实验方案3.10 冻存细胞 43
实验方案3.11 解冻细胞 44
3.8 外周血单核细胞的分离 45
3.8.1 应用密度阻滞 45
3.8.2 应用混合技术 45
3.8.3 应用阻滞漂浮技术 46
实验方案3.12 密度阻滞法纯化人外周血单核细胞 47
实验方案3.13 混合剂技术纯化人外周血单核细胞 47
实验方案3.14 阻滞浮选技术纯化人外周血单核细胞 48
参考文献 49
4 细胞器的分离与功能分析 51
4.1 简介 51
4.2 匀浆化 51
4.3 差速离心 52
4.3.1 器材 53
4.4 密度梯度离心 53
4.5 细胞核及核组分 54
4.5.1 细胞核 54
4.5.2 核组分 54
4.6 线粒体 55
4.6.1 酶标记物 55
4.7 溶酶体 55
4.7.1 酶标记物 55
4.8 过氧化物酶体 56
4.8.1 酶标记物 56
4.9 粗面与光面内质网 56
4.9.1 酶和化学标记物 56
4.10 高尔基膜 57
4.10.1 酶标记物 57
4.11 质膜 57
4.11.1 用酶标记物分析质膜 57
4.12 叶绿体 58
4.12.1 叶绿体功能分析 58
实验方案4.1 用碘克沙醇梯度溶液从哺乳动物肝脏中分离细胞核（并注意培养细胞） 58
实验方案4.2 中期染色体的分离 59
实验方案4.3 核膜的分离 60
实验方案4.4 核孔复合物的分离 61
实验方案4.5 核基质的制备 62
实验方案4.6 核仁的制备 63
实验方案4.7 用差速离心法从大鼠肝脏中分离重线粒体组分 64
实验方案4.8 从组织和培养细胞中制备轻线粒体组分 65
实验方案4.9 用Nycodenz？不连续梯度溶液纯化酵母线粒体 66
实验方案4.10 用中等载量Nycodenz？不连续梯度溶液从哺乳动物肝脏或培养细胞中纯化线粒体 67
实验方案4.11 琥珀酸-碘代硝基四唑盐紫还原酶检测 68
实验方案4.12 不连续Nycodenz？梯度溶液中溶酶体的分离 68
实验方案4.13 β-半乳糖苷酶（分光光度测定） 69
实验方案4.14 β-半乳糖苷酶（荧光测定） 70
实验方案4.15 碘克沙醇梯度提取哺乳动物的过氧化物酶体 70
实验方案4.16 过氧化氢酶检测 71
实验方案4.17 碘克沙醇梯度溶液分析主要细胞器 72
实验方案4.18 蔗糖梯度溶液分离光面及粗面内质网 74
实验方案4.19 以自生成碘克沙醇梯度溶液分离光面与粗面内质网 75
实验方案4.20 NADPH-细胞色素c还原酶检测 76
实验方案4.21 葡萄糖-6磷酸酶检测 77
实验方案4.22 RNA分析 78
实验方案4.23 从肝脏分离高尔基膜 78
实验方案4.24 UDP半乳糖半乳糖基转移酶的检测 79
实验方案4.25 人血影细胞的纯化 80
实验方案4.26 大鼠肝脏中细胞膜的分离 81
实验方案4.27 5′-核苷酸酶测定 82
实验方案4.28 碱性磷酸二酯酶测定 82
实验方案4.29 哇巴因敏感的Na+/K+-ATP酶测定 83
实验方案4.30 绿叶或豌豆幼苗中叶绿体的分离 84
实验方案4.31 叶绿体中叶绿素含量的测定 85
实验方案4.32 叶绿体完整性的测定 85
参考文献 86
5 在跨膜运输和细胞信号转导研究中使用的亚细胞膜的分级分离方法 89
5.1 简介 89
5.2 可采用的研究方法 89
5.3 质膜区域 90
5.4 参与内质网-高尔基体-质膜路径的膜区室的分析 90
5.4.1 蔗糖-D20梯度 90
5.4.2 浮力密度碘克沙醇梯度（预形成） 91
5.4.3 沉降速度碘克沙醇梯度（预形成） 91
5.4.4 用SDS-PAGE和蛋白印迹进行分析 91
5.5 从胞浆蛋白中分离膜囊泡 92
5.6 内吞作用 92
5.6.1 配体标记 92
5.6.2 组织系统 92
5.6.3 细胞系统 92
5.6.4 分析 93
实验方案5.1 利用蔗糖梯度从哺乳动物肝脏分离基底外侧和胆汁小管的质膜区域 93
实验方案5.2 用抗体结合珠分离大鼠肝脏窦状区域 94
实验方案5.3 用蔗糖梯度溶液从Caco-2分离顶端和基底外侧区域 94
实验方案5.4 碘克沙醇梯度离心法从MDCK细胞中分离顶端和基底外侧区域 95
实验方案5.5 脂筏的分离 97
实验方案5.6 细胞膜小凹的分离 99
实验方案5.7 利用不连续蔗糖-D2O密度梯度分析细胞的高尔基体和内质网亚结构 100
实验方案5.8 利用连续碘克沙醇密度梯度法分析细胞的高尔基体、内质网、内质网-高尔基体中间复合物和其他膜结构 101
实验方案5.9 利用连续或非连续沉淀速率碘克沙醇密度梯度分析细胞的高尔基体、内质网、反式高尔基网络和其他膜结构 103
实验方案5.10 细胞膜蛋白的SDS-PAGE 105
实验方案5.11 半干印迹 106
实验方案5.12 用增强化学发光法检测印迹蛋白 106
实验方案5.13 从哺乳动物细胞和细菌中分离胞膜以及胞质组分 107
实验方案5.14 分析在碘克沙醇组分中的早期和再循环的内吞体、转染的MDCK细胞中对转铁蛋白的内吞作用 109
实验方案5.15 利用自生成的碘克沙醇梯度分析笼形蛋白包被囊泡的加工、大鼠肝脏无唾液酸糖蛋白的内吞作用 111
实验方案5.16 多聚蔗糖-Nycodenz？梯度用于分析哺乳动物肝脏中致密内体-溶酶体活动 112
参考文献 113
6 体外实验技术 117
6.1 简介 117
实验方案6.1 使用人类无细胞系统的偶联DNA修复合成的核小体装配 117
实验方案6.2～实验方案6.4——简介 121
实验方案6.2 用卤代脱氧胸腺嘧啶核苷类似物单标新生DNA 121
实验方案6.3 用不同卤代脱氧胸腺嘧啶核苷类似物双标DNA 123
实验方案6.4 同时对蛋白质和取代卤素-dU的DNA进行免疫染色 125
实验方案6.5 暴露培养细胞内的核基质 127
实验方案6.6～实验方案6.7 核基质与核纤层的相互作用——简介 131
实验方案6.6 核基质-核纤层蛋白相互作用：体外印迹覆盖分析 132
实验方案6.7 核基质-核纤层蛋白相互作用：体外核重组装分析 133
实验方案6.8 非洲爪蛙卵提取物的制备和免疫耗竭 136
实验方案6.9 体外核组装和免疫荧光 138
实验方案6.10 应用离体非洲爪蛙卵母细胞核检测核质之间的转运 140
实验方案6.11 在核膜片的微阵列中用光学单转运体记录的方法检测转运 143
6.2 细胞和膜系统 146
实验方案6.12 链球菌溶血素0导致的细胞透化作用 146
实验方案6.13 纳米胶囊：细胞内传送药物的新型载体 147
实验方案6.14 酵母中抗氧化蛋白保护作用的检测方法的快速筛选 150
实验方案6.15 神经细胞凋亡的体外检测 153
实验方案6.16～实验方案6.20 线粒体膜通透性的转变——简介 156
实验方案6.16 线粒体膜通透性转变的测定：共聚焦激光成像法检测细胞或分离的线粒体中通透性转变与△φm的降低 157
实验方案6.17 线粒体膜通透性转变的测定：用罗丹明123通过荧光计来检测通透性转变与△φm的降低 158
实验方案6.18 线粒体膜通透性转变的测定：用流式细胞仪检测细胞及分离的线粒体中通透性转变与△φm的降低 159
实验方案6.19 用蛋白印迹检测分离的线粒体中细胞色素c的释放 160
实验方案6.20 将蛋白质输入分离的线粒体 160
实验方案6.21 体外三元可溶性NSF附着蛋白受体复合物的生成 161
实验方案6.22 肝脏内质网的体外重构 163
实验方案6.23 糖脂不对称地掺入膜以及脂质跨膜运动的检测 165
实验方案6.24 从大鼠脑组织纯化网格蛋白包被的囊泡 170
实验方案6.25 在脂单层上重构内吞中间体 171
实验方案6.26 高尔基膜管的形成 173
实验方案6.27 紧密连接组合体 175
实验方案6.28 重构主要捕光叶绿素a-捕光叶绿素b复合体到脂质体 178
实验方案6.29 重构光系统2到脂质体 182
实验方案6.30 体内及体外的高尔基体-波形蛋白相互作用 183
6.3 细胞骨架和纤维系统 188
实验方案6.31 微管过氧化物酶体相互作用 188
实验方案6.32 免疫金免包埋电子显微镜法测定细胞基质蛋白 191
实验方案6.33 紫杉醇和其他微管组装启动子诱导的微管组装 197
实验方案6.34 波形蛋白的产生、纯化和组装及利用电子顺磁共振的研究 201
实验方案6.35 神经丝装配 205
实验方案6.36 微管蛋白诱导α-突触核蛋白形成 209
实验方案6.37 体外合成β-淀粉样纤维 211
实验方案6.38 体外可溶性Aβ1-42肽诱导的τ样过磷酸化 212
实验方案6.39 反义肽 216
实验方案6.40 β-淀粉样蛋白和酶的相互作用 221
实验方案6.41 Aβ的磷酸化 225
实验方案6.42 体外Smitin-肌球蛋白Ⅱ装配测定 228
实验方案6.43 在EF-手型钙结合蛋白S100A4存在条件下，体外组装／拆卸肌球蛋白丝 230
实验方案6.44 体外组装胶原纤维 232
7 细胞和分子生物学参考数据 235
7.1 化学品安全信息 235
7.2 离心资料 238
7.2.1 离心力的计算 238
7.2.2 转子的应用 239
7.2.3 沉淀时间的计算 239
7.2.4 离心设备的保养 239
7.3 放射性同位素数据 240
7.3.1 核酸酶抑制剂 240
索引 242