第一章 DNA克隆概论 1
1.1 DNA克隆的基本原理 2
1.2．基因克隆方式 6
1.3．克隆基因的功能研究 9
第二章 DNA克隆中的工具酶 11
2.1．限制性核酸内切酶 11
2.1.1．限制性核酸内切酶的类型和作用特点 11
2.1.2．常用的限制性核酸内切酶的反应条件和影响因素 19
2.2．DNA聚合酶 21
2.2.1．E.coli DNA聚合酶1 21
2.2.2．T.DNA聚合酶 23
2.3．连接酶 24
2.3.1．T.DNA连接酶 24
2.3.2．T.RNA连接酶 25
2.4．用于DNA克隆的其它酶类 26
2.4.1．核酸外切酶 26
2.4.2．核酸酶S1 26
2.4.3．逆转录酶 28
第三章 DNA克隆载体 30
3.1．质粒载体 30
3.1.1．常用的质粒载体 31
3.1.2．质粒DNA的提取和纯化 38
3.2．λ噬菌体载体 41
3.2.1．常见的λ噬菌体载体 42
3.2.2．λ噬菌体的生长、纯化和DNA提取 48
3.3．柯斯载体（cosmid） 52
3.3.1．柯斯载体的特性 52
3.3.2．常用的柯斯载体 52
3.4．单链载体 58
3.4.1．常用的单链载体 58
3.4.2．单链载体DNA的制备和纯化 60
3.5．广谱宿主载体 65
3.5.1．广谱宿主范围的质粒载体 66
3.5.2．广谱宿主范围的柯斯载体 66
3.5.3．广谱宿主范围的可调表达载体 68
3.5.4．广谱宿主范围的低拷贝数载体 73
3.6．病毒载体 74
3.6.1．动物病毒载体 74
3.6.2．植物病毒载体 87
3.6.3．昆虫病毒载体 89
3.7．特殊载体 93
3.7.1．YAC克隆载体 93
3.7.2．Ti质粒——转移植物基因的质粒载体 93
第四章 载体在DNA克隆中的运用 98
4.1．λ噬菌体载体在构建基因文库中的运用 98
4.1.1．完整的基因文库 98
4.1.2．λ置换载体的克隆原理 98
4.1.3．供体DNA和载体DNA的分离 101
4.1.4．重组和包装 107
4.1.5．用有限的供体DNA构建文库 109
4.1.6．文库的扩增和筛选 111
4.1.7．置换载体的选择 114
4.1.8．宿主细菌的选择 115
4.2．具体操作方法 118
4.2.1．培养基和缓冲液 118
4.2.2．检测酶活性 120
4.2.3．高分子量的真核细胞核DNA的分离 121
4.2.4．Sau3A部分降解 123
4.2.5．NaCl密度梯度分级分离 124
4.2.6．载体DNA的检测和切割 125
4.2.7．最适连接条件的确定 127
4.2.8．杂交筛选 128
4.3．柯斯克隆 130
4.3.1．柯斯克隆的特点 130
4.3.2．柯斯克隆的一般程序 131
4.4．质粒载体在亚克隆中的运用 134
4.4.1．pBR322作亚克隆的一般程序 136
4.4.2．质粒与插入片段的连接 136
4.4.3．转化细菌 138
4.4.4．菌落杂交 139
第五章 cDNA克隆 141
5.1．用于cDNA克隆的mRNA 141
5.2．不同丰度mRNA的cDNA克隆 142
5.2.1．高丰度mRNA的cDNA克隆 142
5.2.2．低丰度mRNA的cDNA克隆 143
5.3．cDNA的合成 143
5.3.1．cDNA第一链的合成 143
5.3.2．cDNA第二链的合成 145
5.3.3．双链cDNA的制备方法 146
5.4．载体的选择及载体DNA的制备 155
5.4.1．λgt10克隆载体的制备 156
5.4.2．λgt11克隆载体的制备 157
5.5．cDNA与载体分子的连接 158
5.5.1．同源多聚尾连接法 158
5.5.2．人工接头或套头（adapters）连接法 159
5.5.3．连接方法 163
第六章 重组DNA导入受体细胞 166
6.1．重组DNA导入细菌细胞——E.coli转化技术 166
6.1.1．菌株的选择 167
6.1.2．用于转化的E.coli菌株的保存 168
6.1.3．转化方式 169
6.1.4．转化的估价 186
6.1.5．转化有关的基本方法 187
6.1.6．特殊应用 188
6.2．重组DNA导入酵母细胞 193
6.2.1．原生质体转化 194
6.2.2．完整细胞的转化 195
6.3．克隆基因导入动物细胞 196
6.3.1．原生质体融合 197
6.3.2．多聚阳离子介导转染 199
6.3.3．磷酸钙DNA共沉淀转染 199
6.3.4．DEAE葡聚糖介导转染 203
6.3.5．电穿孔 204
6.4．植物细胞的转化 206
6.4.1 根瘤脓肝菌共培养法转化原生质体 208
6.4.2 Ti质粒直接转化原生质体 210
第七章 重组子的筛选与鉴定 213
7.1．区分转化子与非转化子的筛选方法 213
7.2．区分重组子与非重组子的筛选方法 214
7.2.1．抗药性标记插入失活法 214
7.2.2．CI基因插入失活法 215
7.2.3．β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 215
7.2.4．凝胶电泳检测法 216
7.3．鉴定含目的DNA片段的重组子的筛选方法 219
7.3.1．同源重组筛选法 219
7.3.2．核酸杂交法 220
7.4．鉴定目的基因产物重组子的方法 231
7.4.1．利用遗传缺陷型寄主细菌筛选目的基因 232
7.4.2．免疫沉淀法检测重组子 232
7.4.3．免疫筛选λ噬菌体载体构建的表达文库 233
7.4.4．细菌菌落的免疫筛选 236
7.4.5．利用寡聚核苷酸筛选λ噬菌体表达载体构建的cDNA文库 237
第八章 克隆DNA的定位诱变 243
8.1．缺失突变 243
8.1.1．简单切离缺失 244
8.1.2．核酸酶Bal31消化产生缺失突变 244
8.1.3．胰DNaseI切割双链闭环DNA产生缺失突变 248
8.1.4．利用核酸外切酶Ⅲ构建细微缺失突变 250
8.2．插入突变 253
8.2.1．简单的特定位点插入 254
8.2.2．利用胰DNaseI进行随机插入 255
8.3．寡聚核苷酸介导定位诱变 256
8.3.1．缺口双链法 258
8.3.2．双引物法 267
8.3.3．掺“U”法 274
第九章 多聚酶链式反应体外扩增DNA 278
9.1．PCR的基本原理 278
9.2．PCR的基本程序 280
9.3．PCR在分子克隆中的应用 282
9.3.1．扩增特定的克隆双链DNA序列 282
9.3.2．选择性扩增特定cDNA片段制备探针 283
9.3.3．利用微量mRNA建立cDNA文库 285
9.3.4．扩增DNA用于序列分析 285
9.3.5．定位诱变与突变分析 289
9.3.6．RNA PCR操作程序 290
9.3.7．扩增DNA序列分析程序 290
第十章 克隆基因在原核细胞中的表达 294
10.1．克隆基因表达的基本概念 294
10.1.1．基因工程的主要内容 294
10.1.2．克隆真核基因表达的条件、困难与措施 294
10.1.3．克隆基因的表达系统 296
10.2．融合蛋白的表达 297
10.2.1．表达融合蛋白的必要条件 297
10.2.2．Lac Z融合基因的表达 298
10.3．完整天然蛋白的表达 301
10.3.1．原核基因的表达 301
10.3.2．真核基因的表达 304
10.4．克隆基因表达的检测与增强 310
10.4.1．克隆基因表达量的检测方法 310
10.4.2．蛋白质检测方法 312
10.4.3．增强克隆基因表达的方法 314
10.5．克隆基因在E.coli中表达的实例 318
10.5.1．生长激素释放抑制因子的表达 318
10.5.2．EB病毒早期抗原融合蛋白的表达 318
10.5.3．HBcAg基因的表达 319
第十一章 克隆基因在真核细胞中的表达 323
11.1．克隆基因在酵母细胞中的表达 323
11.1.1．在酵母细胞中转化与表达的质粒载体 323
11.1.2．外源DNA的导入、整合与复制 324
11.1.3．外源DNA在酵母细胞中的表达 326
11.2．克隆基因在哺乳动物细胞中的转化与表达 330
11.2.1．克隆基因对哺乳动物细胞的转化 330
11.2.2．转化细胞的筛选标志 331
11.2.3．扩增系统 337
11.2.4．蛋白质的表达 338
11.3．克隆基因在昆虫细胞中的表达 344
11.3.1．杆状病毒与昆虫细胞的某些特点 344
11.3.2．外源基因在昆虫细胞中表达的主要步骤 345
11.3.3．影响昆虫细胞表达外源基因的主要因素 346
11.3.4．克隆基因在昆虫细胞中表达的实例 349
参考文献 352