第一章 核酸提取 1
第一节 基因组DNA的制备 1
一、制备植物细胞基因组DNA 1
二、制备动物细胞基因组DNA 3
三、制备细菌基因组DNA 4
四、制备酵母基因组DNA（以Pichia pastoris基因组DNA提取为例） 5
五、结果分析 6
六、基因组DNA提取注意事项 7
第二节 RNA的制备 7
一、动物物RNA提取（以人脐带组织总RNA的抽提为例） 7
二、植物RNA的分离 8
三、绿色叶片植物叶线粒体RNA的分离 12
四、酵母RNA分离 14
五、酵母tRNA制备（苯酚法） 15
六、细菌RNA分离 16
七、结果分析 17
第三节 质粒DNA制备 17
一、大肠杆菌质粒DNA制备（碱裂解法） 17
二、农杆菌质粒DNA提取 19
三、结果分析 24
第二章 cDNA文库构建 27
第一节 应用常规方法构建cDNA文库 27
一、原理 27
二、cDNA第一条链的合成 27
三、cDNA第二条链的合成 30
四、补平cDNA链末端 34
五、cDNA甲基化 35
六、cDNA与接头或衔接子相连接 37
七、凝胶过滤分离cDNA 39
八、cDNA与λ噬菌体臂的连接 40
九、重组子的筛选与鉴定 43
第二节 构建cDNA文库新方法 44
一、减数cDNA文库 44
二、标准化cDNA文库 45
第三节 cDNA文库构建及应用实例 45
一、主要材料 45
二、实验操作要点 46
三、结果及分析 47
第三章 已知目标DNA片段的获取 51
第一节 PCR法扩增目标DNA片段 51
一、原理 51
二、PCR条件 52
三、引物设计原则 52
四、PCR反应特点 53
五、试剂 53
六、温度与时间的设置 54
七、PCR扩增效果的检查 55
八、注意事项 55
九、用PCR扩增目标基因实例 56
十、PCR技术扩展 58
第二节 基因的化学合成 69
一、磷酸二酯法 69
二、磷酸三酯法 71
三、固相亚磷酸三酯法 71
四、用寡核苷酸片段组装 72
第四章 已知部分序列的DNA片段的获取 78
第一节 RACE 78
一、5′RACE 78
二、3′RACE 84
三、RACE方案的PCR优化 86
四、RACE应用实例 86
第二节 染色体步移 87
一、原理 88
二、材料 89
三、实验操作 90
第三节 反向PCR 94
一、原理 94
二、材料 95
三、实验操作 96
四、反向PCR应用实例 97
第四节 锚定PCR 98
一、原理 98
二、以同聚物为锚定引物进行互补锚定PCR扩增已知基因侧翼序列 98
三、用人工合成的特定序列为锚定引物扩增已知基因侧翼序列 103
四、锚定应用实例 104
第五章 未知DNA片段的获取 108
第一节 应用PCR技术获取新基因 108
一、应用简并PCR技术获取新基因 108
二、应用限制性显示PCR（restriction display PCR,RD-PCR）技术获取新基因 111
三、外显子捕获PCR（exon trapping PCR）获取新基因 114
第二节 应用杂交技术获取新基因 120
一、抑制差减杂交法 120
二、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术 127
第三节 应用差异显示技术获取新基因 133
一、原理 133
二、材料 134
三、实验操作 136
四、应用实例 140
第四节 克隆新基因的其他技术 141
第六章 RNAi技术 147
第一节 概述 147
一、定义 147
二、RNAi的发现 147
三、RNAi的作用的可能机制 147
四、RNAi的作用特点 148
五、RNAi的应用 149
六、研究方法 152
七、RNAi研究的一般技术路线 152
第二节 RNAi实验技术 155
一、siRNA序列的选择 155
二、制备长dsRNA分子 155
三、制备siRNA双链体 159
四、细胞培养及24孔板细胞制备 160
五、转染 161
六、基因敲除结果分析 170
七、RNAi应用实例 171
第七章 DNA重组 175
第一节 传统DNA重组技术 175
一、分子克隆载体与宿主 175
二、分子克隆常用的工具酶 184
三、重组载体的构建 190
四、重组DNA导入宿主细胞及其重组子的筛选 197
第二节 重组工程 221
一、细菌中的内源性重组系统（RecA重组系统） 221
二、不依赖RecA的重组系统（来源于噬菌体的重组系统） 221
三、单链DNA重组工程 222
第八章 生产重组蛋白 225
第一节 应用微生物细胞生产重组蛋白 225
一、概述 225
二、应用大肠杆菌生产重组蛋白 235
三、应用Pichia pastoris生产重组蛋白 251
第二节 应用植物生产重组蛋白 259
一、概述 259
二、植物细胞培养基本技术 260
三、在生物反应器中培养植物细胞 284
四、应用植物表达外源蛋白应用实例 288
第三节 应用动物细胞生产重组蛋白 288
一、概述 288
二、动物细胞及组织基本培养技术 295
三、动物细胞发酵工艺 298
四、应用动物细胞生产重组蛋白实例 303
第九章 纯化技术 307
第一节 材料的选择与处理 307
一、材料的选择、样品的保存与发酵液的预处理 307
二、细胞的破碎 307
第二节 抽提、萃取与浓缩 308
一、抽提目标成分 308
二、萃取 311
三、浓缩技术 311
第三节 层析 320
一、吸附层析（absorption chromatography） 320
二、分配层析（partition chromatography） 320
三、离子交换层析（ion-exchange chromatography） 321
四、凝胶过滤层析 332
五、亲和层析 336
第四节 纯化技术应用实例 339
一、Pichia pastoris分泌重组蛋白的纯化（以纯化重组angiostatin为例） 339
二、大肠杆菌中表达产物（包涵体）的纯化（以纯化重组careticulin-N58为例） 340
第十章 电泳技术 346
第一节 概述 346
一、电泳技术原理 346
二、影响电泳迁移率的因素 346
三、电泳技术的分类 347
第二节 醋酸纤维素薄膜电泳 347
一、材料 347
二、实验操作 348
三、应用 349
第三节 琼脂糖凝胶电泳 349
一、原理 349
二、特点 350
三、材料 350
四、实验操作 350
五、应用 351
第四节 SDS-PAGE 351
一、原理 351
二、材料 352
三、实验操作 354
第五节 双向电泳 359
一、原理 359
二、实验操作 359
第六节 毛细管电泳 369
一、概述 369
二、原理 369
三、分离模式 370
四、毛细管电泳的应用 371
五、应用实例 372
第十一章 杂交技术 375
第一节 核酸分子杂交 375
一、原理 375
二、常用探针的种类及其制备 375
三、杂交 385
第二节 蛋白印迹（Western Blot） 398
一、原理 398
二、材料 399
三、实验操作 400
第十二章 生物质谱技术 404
第一节 生物质谱（biological mass spectrometry）的特点与应用 404
一、生物质谱的特点 404
二、生物质谱的应用 404
第二节 生物质谱基本技术 407
一、质谱仪的主要元件 407
二、生物质谱工作基本原理 408
三、生物质谱基本方法（举例） 410
四、色谱-质谱联机 412
第十三章 生物芯片 417
第一节 概述 417
一、生物芯片技术的形成 417
二、生物芯片的分类 417
第二节 生物芯片的操作原理及其操作程序 419
一、操作原理 419
二、操作程序 420
第三节 生物芯片具体操作方法及应用 430
一、生物芯片具体操作方法 430
二、生物芯片应用概述 433
三、生物芯片应用实例 436
第四节 生物芯片技术的难点与展望 438
第十四章 噬菌体展示技术 443
第一节 概述 443
一、原理 443
二、用于噬菌体展示的表达载体 443
三、噬菌体显示与筛选技术 443
四、应用 444
第二节 噬菌体展示实验技术应用实例（用噬菌体展示技术筛选CCR5亲和短肽） 445
一、材料 445
二、实验操作 447
三、结果与分析 450
第十五章 生命大分子相互作用分析 461
第一节 酵母单杂交 461
一、原理 462
二、材料 462
三、实验操作 464
第二节 酵母双杂交 470
一、原理 470
二、材料 471
三、实验操作 474
第三节 酵母三杂交系统 482
一、原理 482
二、酵母三杂交系统的应用 482
三、常用载体和菌株 483
四、基本实验操作举例 483
第四节 DNase Ⅰ足迹法研究DNA蛋白质相互作用 487
一、原理 487
二、材料 487
三、实验操作 488
第十六章 生物信息学概况及生物信息数据库 491
第一节 生物信息学概况 491
一、生物信息学的产生和发展 491
二、生物信息学的研究内容 491
第二节 生物信息数据库 493
一、核酸数据库 493
二、蛋白质数据库 495
三、其他数据库资源 498
第三节 生物信息学应用实例 508
一、生物信息学在作物抗性研究中的应用 508
二、生物信息学与人类基因组计划 510