绪论 1
一、发酵工程实验的特点 1
（一）发酵工程实验的目的和要求 1
（二）实验室的一般要求 2
二、发酵工程实验室的特点与要求 3
（一）发酵工程实验的特点 3
（二）发酵工程实验的要求 3
（三）发酵工程实验室的安排 5
三、发酵工程实验设计（方案）的基本步骤 5
（一）实验设计（方案）的内容及要求 5
（二）实验设计（方案）的拟定步骤 6
（三）数据回归分析 22
四、发酵工程实验常用的设备 22
（一）摇瓶 22
（二）摇床 23
（三）发酵罐 26
第一部分 基本技能实验 31
第一章 菌种改造 31
第一节 菌种分离纯化和自然选育 31
第二节 微生物的诱变育种 32
（一）诱变育种步骤 32
（二）物理诱变与化学诱变 34
第三节 富集培养技术在育种中的应用 37
（一）抗性突变株的富集 37
（二）营养缺陷型的富集 38
第四节 原生质体育种 41
（一）标记菌株的筛选 41
（二）原生质体的制备 42
（三）原生质体的再生 43
（四）原生质体的融合 44
（五）融合子的选择 45
实验一 菌种的分离纯化 45
实验二 紫外诱变 48
实验三 微波诱变 51
实验四 亚硝基胍诱变 53
实验五 噬菌体的分离和测定 54
实验六 抗噬菌体菌种选育 57
实验七 氨基酸抗反馈调节突变株的选育 60
实验八 大肠杆菌营养缺陷型的筛选 63
实验九 原生质体制备及再生 65
实验十 原生质体融合 68
第五节 基因组改组技术 69
第六节 微生物基因工程技术及其在微生物育种中的应用 70
（一）目的基因的获取 70
（二）克隆载体的选择与构建 71
（三）外源基因与载体的连接 71
（四）重组DNA导入受体细胞 72
（五）重组体的筛选 72
（六）克隆基因的表达 72
（七）PCR技术扩增目的基因 73
实验十一 基因组改组技术筛选蛋白酶高产菌株 77
实验十二 基因组DNA的提取 80
实验十三 煮沸法快速提取质粒DNA 83
实验十四 碱裂解法抽提质粒DNA与鉴定 85
实验十五 DNA的限制性内切酶消化 88
实验十六 琼脂糖电泳检测DNA 89
实验十七 PCR技术扩增枯草杆菌deoD基因 91
实验十八 重组T质粒的构建 93
实验十九 感受态的制备和转化 94
实验二十 重组质粒的鉴定——菌落PCR 97
第二章 培养基配制与灭菌 99
第一节 培养基的配制 99
（一）微生物的营养需求及对物质的吸收 99
（二）培养基 102
（三）培养基的配制 107
第二节 高压蒸汽灭菌 111
（一）灭菌与消毒的基本概念 111
（二）高压蒸汽灭菌的原理 113
（三）高压灭菌设备 116
实验二十一 培养基的配制 118
实验二十二 高压灭菌锅的使用 121
第三章 摇瓶发酵 124
第一节 发酵原理 124
（一）营养 124
（二）温度 126
（三）pH 126
（四）溶氧 127
第二节 摇瓶发酵实验 128
实验二十三 接种工具的认识与灭菌 128
实验二十四 接种和移种 130
实验二十五 枯草芽孢杆菌生产腺苷 132
实验二十六 重组大肠杆菌羧肽酶的表达 135
实验二十七 洛伐他汀发酵 137
实验二十八 林可霉素发酵 140
实验二十九 四环素类抗生素定向发酵 142
实验三十 β-半乳糖苷酶生成的调节 145
实验三十一 芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶 148
第四章 发酵生化参数的测定 151
第一节 生化参数测定原理 151
第二节 生化参数分析方法 154
实验三十二 比浊法测定发酵液中大肠杆菌浓度 154
实验三十三 测定菌体干重 155
实验三十四 紫外分光光度法定量测定细胞总核酸 156
实验三十五 红霉素效价的化学法测定一 157
实验三十六 红霉素效价的化学法测定二 158
实验三十七 红霉素生物效价的测定 159
实验三十八 二剂量法测定林可霉素生物效价 161
实验三十九 利福霉素化学效价的测定 164
实验四十 柠檬酸含量测定一 165
实验四十一 柠檬酸含量测定二 167
实验四十二 衣康酸含量测定 168
实验四十三 丙酮酸含量测定 170
实验四十四 用SBA-40C型生物传感分析仪测定谷氨酸和谷氨酰胺 172
实验四十五 华勃氏呼吸仪测定谷氨酸的含量 174
实验四十六 双缩脲法测定蛋白质含量 177
实验四十七 Folin-酚法测定蛋白质浓度 178
实验四十八 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 180
实验四十九 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测蛋白表达和测定蛋白质相对分子质量 181
实验五十 发酵液中糖含量的测定 184
实验五十一 DNS法测定还原糖浓度 187
实验五十二 酶试剂盒法测定葡萄糖含量 188
实验五十三 SBA-40型谷氨酸（乳酸）-葡萄糖双功能分析仪测定葡萄糖含量 189
实验五十四 发酵液氮含量的测定 192
实验五十五 靛酚蓝法测定铵离子 193
实验五十六 钼酸铵法测定无机磷 195
实验五十七 还原法测定无机磷 196
实验五十八 钼钒法测定无机磷 198
实验五十九 无细胞抽提液的制备 199
实验六十 葡萄糖激酶的酶活测定 200
实验六十一 磷酸果糖激酶的测定 202
实验六十二 异柠檬酸脱氢酶活力测定 204
实验六十三 6-磷酸葡萄糖脱氢酶的测定 205
实验六十四 丙酮酸激酶活力测定 207
实验六十五 柠檬酸合成酶活力测定 209
实验六十六 碱性磷酸酶（AKP）酶活测定 210
实验六十七 脂肪酶活力测定 212
实验六十八 碱性蛋白酶活力测定 214
实验六十九 酰基激酶活力的测定 216
实验七十 酰基CoA合成酶活力的测定 217
第五章 色谱分析在发酵工程中的应用 220
第一节 色谱分析概述 220
（一）气相色谱法的特点 220
（二）气相色谱分离条件的选择 221
（三）液相色谱法的特点 223
（四）高效液相色谱分析方法的建立 224
第二节 色谱法在发酵工程中的应用 226
（一）反相HPLC双检测器法同时测定发酵液中的有机酸与葡萄糖 226
（二）AQC柱前衍生高效液相色谱法测定发酵液中21种氨基酸 228
（三）利用反相高效液相色谱法测定发酵液中的生物素含量 230
（四）利用乙腈作为内标气相色谱法快速测定发酵液中的乳酸 232
第六章 过程工程参数测定 234
第一节 微生物反应器的混合原理 234
第二节 微生物反应器的氧传递过程原理 236
实验七十一 亚硫酸钠氧化法测定氧传递系数KLa 238
实验七十二 用溶氧电极法的动态法测定氧传递系数KLa 240
实验七十三 混合时间测定 242
第二部分 综合实验 247
第七章 微生物培养 247
实验一 ε-聚赖氨酸生产菌株的选育与发酵工艺的研究 247
实验二 D-核糖发酵 250
实验三 重组大肠杆菌发酵人铜锌超氧化物歧化酶的高密度、高表达 254
实验四 黑曲霉产纤维素酶液体发酵 256
实验五 拟干酪乳杆菌发酵生产乳酸 261
实验六 嘌呤核苷磷酸化酶在大肠杆菌中表达和酶学性质测定 265
实验七 酶催化蔗糖转化反应 269
实验八 酵母培养中的基质代谢、呼吸和生长的参数检测与参数相关分析 275
实验九 酵母菌厌氧乙醇发酵 279
实验十 重组毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶及其分离纯化 283
第八章 动物细胞培养 292
实验十一 造血细胞分离、集落培养及表型分析 292
实验十二 动物细胞的培养和计数 295
实验十三 细胞的冷冻和复苏 298
参考文献 300