第一篇 生化分离技术 2
第一章 提取与沉淀分离技术 2
第一节 细胞破碎 2
一、机械破碎法 2
二、物理破碎法 3
三、化学破碎法 4
四、酶促破碎法 4
第二节 提取 4
一、提取的方法 5
二、影响提取的因素 6
第三节 沉淀分离 6
一、盐析沉淀法 7
二、等电点沉淀法 10
三、有机溶剂沉淀法 10
四、复合沉淀法 11
五、金属盐沉淀法 11
六、选择性变性沉淀法 12
第四节 实验 12
实验1-1大肠杆菌细胞的超声波破碎 12
实验1-2枯草杆菌碱性磷酸酶的提取与盐析 13
实验1-3枯草杆菌DNA的提取与分离 14
实验1-4酵母RNA的提取与分离 15
实验1-5大蒜细胞SOD的提取与分离 16
实验1-6大鼠肝rRNA的提取与分离 17
第二章 过滤与膜分离技术 19
第一节 非膜过滤 19
一、非膜过滤的分类 19
二、非膜过滤的操作过程 20
第二节 膜分离技术 20
一、膜分离的分类 21
二、膜分离的操作过程及其控制 22
第三节 实验 23
实验2-1胰凝乳蛋白酶的透析脱盐 23
实验2-2糖化酶的超滤分离 24
第三章 萃取分离技术 26
第一节 有机溶剂萃取 26
一、有机溶剂的选择 26
二、有机溶剂萃取的操作过程 26
第二节 双水相萃取 27
一、双水相萃取的原理 27
二、双水相萃取的操作过程 27
第三节 超临界萃取 28
一、超临界萃取的原理 29
二、超临界萃取的操作过程 29
第四节 反胶束萃取 31
一、反胶束萃取的原理 31
二、反胶束萃取的操作过程 31
第五节 实验 32
实验3-1青蒿素的超临界萃取分离 32
实验3-2人生长激素的双水相萃取分离 33
实验3-3穿心莲内酯的有机溶剂萃取 34
第四章 层析分离技术 35
第一节 吸附层析 35
一、吸附层析原理 35
二、吸附柱层析 36
三、聚酰胺薄膜层析 39
四、其他吸附层析 39
第二节 分配层析 39
一、纸层析 40
二、薄层层析 43
三、气相层析 45
第三节 离子交换层析 52
一、离子交换剂的选择与处理 53
二、离子交换层析的操作过程 54
第四节 凝胶层析 55
一、凝胶层析的基本原理 55
二、凝胶的选择与处理 57
三、凝胶层析操作过程 58
第五节 亲和层析 60
一、亲和层析母体和配基 60
二、亲和层析方法 61
第六节 层析聚焦 62
一、交换剂和缓冲液体系 63
二、pH梯度的形成 63
三、层析聚焦的操作过程 63
第七节 实验 64
实验4-1蛋白质溶液的凝胶层析脱盐 64
实验4-2氨基酸的纸层析 64
实验4-3核苷酸的离子交换层析 66
实验4-4胰蛋白酶的亲和层析 68
实验4-5凝胶层析测定蛋白质的相对分子质量 69
实验4-6 DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析 70
实验4-7醇酯成分的气相层析 72
实验4-8胆酸混合液的薄层层析 74
第五章 电泳技术 75
第一节 电泳的基本原理 75
第二节 纸电泳 76
一、缓冲液的选择 76
二、滤纸的选择与剪裁 76
三、电泳操作要点 76
第三节 薄层电泳 78
第四节 薄膜电泳 78
第五节 凝胶电泳 79
一、聚丙烯酰胺凝胶的制备原理 79
二、不连续电泳中样品压缩成层的原理 80
三、SDS-凝胶电泳原理 81
四、凝胶电泳的操作要点 81
第六节 等电点聚焦电泳 82
一、稳定pH梯度的形成 83
二、两性电解质载体 83
三、支持pH梯度的介质 83
四、等电点聚焦电泳的操作要点 84
第七节 实验 85
实验5-1核苷酸的纸电泳 85
实验5-2蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳 86
实验5-3 DNA的琼脂糖凝胶电泳 87
实验5-4蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 88
实验5-5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 90
实验5-6蛋白质的二元凝胶电泳 91
第六章 离心分离技术 94
第一节 离心机的选择 94
一、常速离心机 94
二、高速离心机 94
三、超速离心机 94
第二节 离心方法的选择 95
一、差速离心 95
二、密度梯度离心 96
三、等密度梯度离心 97
第三节 离心条件的确定 98
一、离心力 98
二、离心时间 98
三、温度 99
四、pH 99
第四节 实验 99
实验6-1细菌核糖体的分离 99
实验6-2大肠杆菌细胞膜的分离 100
实验6-3 RNA的蔗糖密度梯度离心分离 101
实验6-4 大鼠肝细胞核的分离 102
第二篇 生化检测技术 104
第七章 化学检测技术 104
第一节 糖类的化学检测 104
一、蓝-爱农法 104
二、斐林试剂快速法 105
三、次碘酸钠法 106
四、铜试剂法 107
第二节 蛋白质和氨基酸的化学检测 108
一、定氮法测定蛋白质的含量 108
二、双缩脲试剂法测定蛋白质含量 109
三、福林-酚试剂法测定蛋白质含量 109
四、蛋白质N端氨基酸丹磺酰化测定法 110
五、蛋白质的氨基酸排列顺序测定——埃德曼分析法 111
六、蛋白质N端氨基酸2，4-二硝基氟苯测定法 113
七、茚三酮显色法测定氨基酸含量 115
八、甲醛滴定法测定氨基酸 116
第三节 蛋白质的免疫化学检测 116
一、基本概念与原理 116
二、蛋白质的免疫化学检测方法 117
第四节 核酸的化学检测 118
一、定磷法测定核酸含量 118
二、二苯胺法测定DNA含量 119
三、地衣酚法测定RNA含量 119
第五节 实验 120
实验7-1斐林试剂置换法测定还原糖 120
实验7-2葡萄糖淀粉酶的活力测定 121
实验7-3微量凯氏定氮法测定总氮量 122
实验7-4福林-酚试剂法测定蛋白质含量 124
实验7-5丹磺酰化法分析蛋白质N端氨基酸 124
实验7-6异硫氰酸苯酯分析法测定肽链的氨基酸排列次序 125
实验7-7茚三酮显色法测定氨基酸含量 127
实验7-8双向免疫扩散法测定抗血清效价 128
实验7-9定磷法测定核酸含量 129
实验7-10地衣酚显色法测定核糖核酸（RNA）含量 130
实验7-11二苯胺显色法测定DNA含量 131
第八章 光学检测技术 132
第一节 旋光检测技术 132
一、原理 132
二、操作要点 133
第二节 荧光检测技术 133
一、邻苯二甲醛荧光分析法测定氨基酸 133
二、荧光胺荧光分析法测定肽含量 134
第三节 分光光度检测技术 135
一、原理 135
二、操作要点 136
第四节 实验 137
实验8-1旋光法测定味精的纯度 137
实验8-2荧光法测定核黄素含量 138
实验8-3荧光法测定氨基酸含量 139
实验8-4紫外线吸收法测定核酸含量 139
实验8-5紫外线吸收法测定蛋白质含量 140
第九章 酶学检测技术 141
第一节 酶学检测技术的特点 141
一、酶学检测的专一性强 141
二、酶学检测的灵敏度高 141
三、酶学检测的速度快 141
四、酶学检测的条件温和 141
第二节 酶法分析技术 142
一、酶法分析的基本过程 142
二、常用于酶法分析的酶及其检测方法 142
第三节 酶联免疫吸附检测技术 144
一、ELISA的基本原理 144
二、ELISA常用的标记酶 144
三、常用的ELISA方法 146
四、ELISA技术的应用 147
第四节 实验 148
实验9-1利用酶法分析测定鸡蛋中总胆固醇的含量 148
实验9-2利用酶法分析快速测定发酵液中的L-乳酸 149
实验9-3利用酶法分析测定发酵液中葡萄糖的浓度 151
实验9-4酶联免疫吸附检测法（双抗体夹心法）检测艰难梭菌毒素 152
实验9-5酶联免疫吸附检测法（间接法）测定兔血清免疫球蛋白IgG 153
第十章 气体检测技术 155
第一节 华勃氏呼吸仪检压法 156
第二节 范·斯莱克检测仪测定α-氨基酸含量 158
第三节 实验 158
实验10-1酵母细胞耗氧量的测定 158
实验10-2华勃氏呼吸仪测定L-谷氨酸脱羧酶活力 159
实验10-3华勃氏呼吸仪测定L-谷氨酸含量 160
第十一章 生物检测技术 162
第一节 安全性试验 162
一、毒性试验 162
二、局部刺激性试验 163
三、溶血试验 163
四、热原试验 163
五、过敏试验 164
第二节 生长抑制物质的生物效价测定 164
一、稀释法 165
二、扩散法 165
第三节 生长促进物质的生物效价检测 167
一、稀释法 167
二、扩散法 167
三、比浊法 167
四、滴定法 167
第四节 实验 168
实验11-1卡那霉素的效价测定 168
实验11-2二环素的杀菌能力测定 169
实验11-3细胞病变抑制法测定于犹素的效价 170
实验11-4热原试验 171
第十二章 放射性同位素检测技术 173
第一节 基本知识 173
一、放射性同位素 173
二、放射性同位素的衰变与射线 173
三、衰变规律 174
四、放射线的防护 174
第二节 放射性同位素的检测 175
一、放射自显影技术 175
二、盖革计数管探测 176
三、闪烁计数器探测 177
第三节 放射性同位素的掺入 177
第四节 实验 178
实验12-1 γ-32P-ATP的酶促合成 178
实验12-2 3H-蛋白质的生物合成 179
实验12-3 3H-蛋白质凝胶的放射荧光显影 179
第三篇 酶、基因和细胞操作技术 182
第十三章 酶操作技术 182
第一节 酶生物合成的调节技术 182
一、酶的诱导合成 182
二、酶生物合成的阻遏 184
第二节 酶反应动力学的研究技术 185
一、酶反应初速率的测定 185
二、底物浓度对反应速率的影响——Km和v max的测定 185
三、最适温度、热稳定性和活化能的测定 187
四、最适pH的测定 188
五、酶的激活与抑制 188
第三节 酶、细胞和原生质体固定化技术 189
一、吸附法固定化技术 189
二、包埋法固定化技术 190
三、结合法固定化技术 191
四、交联固定化技术 192
第四节 酶分子修饰技术 193
一、金属离子置换修饰 193
二、大分子结合修饰 193
三、酶的侧链基团修饰 194
四、肽链有限水解修饰 196
五、核苷酸链的剪切修饰 197
六、氨基酸置换修饰 197
七、核苷酸置换修饰 198
八、酶分子的物理修饰 198
第五节 酶分子定向进化技术 199
一、基因体外随机突变技术 199
二、突变基因的高通量筛选技术 201
第六节 实验 204
实验13-1 β-半乳糖苷酶的诱导合成 204
实验13-2无机磷酸对枯草杆菌碱性磷酸酶生物合成的阻遏作用 205
实验13-3碱性磷酸酶的反应动力学性质 206
实验13-4 L-谷氨酸脱羧酶的固定化 208
实验13-5枯草杆菌细胞固定化 209
实验13-6谷氨酸棒杆菌原生质体固定化 209
实验13-7固定化原生质体生产谷氨酸脱氢酶 210
实验13-8采用易错PCR技术提高扁桃酸酯酶的立体选择性 211
实验13-9利用DNA重排技术提高β-甘露聚糖酶的温度耐受性 213
第十四章 基因操作技术 216
第一节 基因的获取技术 216
一、分离法 216
二、反转录法 217
三、化学合成法 218
四、聚合酶链反应技术 219
第二节 载体的制备技术 221
一、载体的分类 221
二、载体的制备 221
第三节 DNA体外重组技术 223
一、黏性末端连接 223
二、平头末端连接 224
三、修饰末端连接 225
第四节 重组DNA引入受体细胞技术 225
一、受体细胞的筛选与处理 225
二、外源DNA引入受体细胞 226
第五节 重组DNA的鉴定技术 227
一、DNA印迹技术 227
二、RNA印迹技术 228
三、蛋白质印迹技术 228
四、DNA序列测定技术 229
第六节 实验 232
实验14-1大肠杆菌ColE Ⅰ质粒的分离 232
实验14-2重组DNA的细胞转化 233
实验14-3 Sanger测序法测定基因的序列 234
实验14-4 DNA印迹杂交 235
实验14-5 PCR扩增目的基因 236
实验14-6碱裂解法提取质粒DNA 237
第十五章 细胞操作技术 239
第一节 动物细胞融合技术 239
一、细胞的制备 239
二、细胞融合 240
三、融合子的筛选 240
第二节 原生质体融合技术 241
一、原生质体制备 241
二、原生质体融合 244
三、细胞壁的再生 245
四、融合子的筛选 245
第三节 细胞拆合技术 246
一、细胞器的分离 246
二、细胞器重组 247
第四节 实验 248
实验15-1枯草杆菌原生质体的制备 248
实验15-2酵母原生质体的分离与再生 249
实验15-3从胡萝卜细胞分离原生质体 250
实验15-4动物细胞微核体和胞质体的制备 250
主要参考文献 252
附录 253