第一章 基因工程概述 1
第一节 基因操作与基因工程 1
一、基因操作与基因工程的关系 1
二、基因工程的诞生与发展 2
第二节 基因工程是生物科学发展的必然产物 4
一、基因是基因重组的物质基础 4
二、DNA的结构和功能 5
三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展 7
四、基因工程的内容 9
第三节 基因的结构——基因操作的理论基础 10
一、基因的结构组成对基因操作的影响 10
二、基因克隆的通用策略 11
思考题 12
主要参考文献 12
第一篇 基因操作原理 17
第二章 分子克隆工具酶 17
第一节 限制性内切酶 17
一、限制与修饰 17
二、限制酶识别的序列 20
三、限制酶产生的末端 21
四、DNA末端长度对限制酶切割的影响 25
五、位点偏爱 26
六、酶切反应条件 27
七、星星活性 28
八、单链DNA的切割 29
九、酶切位点的引入 29
十、影响酶活性的因素 29
十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性 30
第二节 甲基化酶 30
一、甲基化酶的种类 30
二、依赖于甲基化的限制系统 31
三、甲基化对限制酶切的影响 31
第三节 DNA聚合酶 32
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 32
二、Klenow DNA聚合酶 33
三、T4噬菌体DNA聚合酶 34
四、T7噬菌体DNA聚合酶 34
五、耐热DNA聚合酶 34
六、反转录酶 34
七、末端转移酶 35
第四节 其他分子克隆工具酶 35
一、依赖于DNA的RNA聚合酶 35
二、连接酶 36
三、T4多核苷酸激酶 37
四、碱性磷酸酶 37
五、核酸酶 37
六、核酸酶抑制剂 39
七、琼脂糖酶 39
八、DNA结合蛋白 39
九、其他酶 39
思考题 40
主要参考文献 40
第三章 分子克隆载体 41
第一节 质粒载体 41
一、质粒的基本特性 41
二、标记基因 43
三、质粒载体的种类 45
第二节 λ噬菌体载体 48
一、λ噬菌体的分子生物学 48
二、λ噬菌体载体的选择标记 53
三、代表性λ噬菌体载体 54
四、λ噬菌体载体的克隆原理及步骤 59
五、λ噬菌体位点特异性重组系统在基因克隆中的应用 62
第三节 单链丝状噬菌体载体 63
一、M13噬菌体的生物学 64
二、M13噬菌体载体 65
三、M13噬菌体载体的宿主菌 67
四、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 70
五、噬菌粒 71
六、M13KO7辅助噬菌体 71
思考题 72
主要参考文献 72
第四章 人工染色体载体 74
第一节 黏粒载体 75
一、黏粒的结构特征和用途 75
二、黏粒载体的工作原理 75
三、黏粒克隆载体 77
四、黏粒文库的扩增和贮存 78
五、构建黏粒文库应注意的问题 79
第二节 酵母人工染色体载体 80
一、YAC载体的复制元件和标记基因 80
二、YAC载体的工作原理 81
第三节 细菌人工染色体载体 82
一、BAC载体及其结构组成 83
二、BAC载体工作原理 83
三、控制拷贝数的BAC载体和Fosmid载体 84
第四节 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体 84
一、P1噬菌体的分子遗传特征 85
二、P1噬菌体载体 86
三、P1人工染色体载体 87
思考题 89
主要参考文献 89
第五章 表达载体 90
第一节 大肠杆菌表达载体 90
一、大肠杆菌表达载体的结构 90
二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 92
三、利用大肠杆菌固有基因启动子的表达载体 94
四、表达融合蛋白的表达载体 95
五、无细胞体系蛋白质表达系统 99
六、表达产物的纯化 100
七、蛋白表达中可能存在的问题 101
第二节 穿梭载体 102
一、大肠杆菌／革兰氏阳性细菌穿梭载体 103
二、大肠杆菌／酵母菌穿梭载体 103
三、其他穿梭载体 104
第三节 整合载体 104
一、基因插入／基因敲除 104
二、随机插入突变载体 105
思考题 108
主要参考文献 108
第六章 基因操作中大分子的分离和检测 109
第一节 DNA的分离、检测和纯化 109
一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化 109
二、基因组DNA的分离 110
三、DNA的琼脂糖凝胶电泳 112
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 113
五、脉冲场凝胶电泳 113
六、紫外吸收法检测DNA的浓度和纯度 114
七、DNA片段的纯化 115
第二节 RNA的分离、检测和纯化 116
一、控制潜在RNA酶的活性 116
二、RNA的抽提和纯化 116
三、mRNA的纯化 117
四、RNA的电泳检测 117
第三节 分子杂交 118
一、Southern杂交 118
二、Northern杂交 119
三、Western杂交 119
四、其他分子杂交 119
五、DNA微阵列分析 120
六、探针的标记 121
第四节 重组DNA分子导入大肠杆菌 124
一、CaCl2转化法 124
二、电转化法 125
思考题 126
主要参考文献 126
第七章 基因操作中的核酸分析技术 127
第一节 DNA和蛋白质相互作用分析 127
一、凝胶阻滞实验 127
二、DNase Ⅰ足迹实验 128
三、体内足迹实验 129
四、酵母单杂交技术 130
五、染色质免疫沉淀法 131
六、DNA-蛋白质相互作用研究技术的新进展 132
第二节 RNA作图和端点分析 133
一、RNA的S1核酸酶作图 134
二、S1核酸酶作图分析mRNA的端点 135
三、引物延伸法分析mRNA的端点 135
第三节 RNA干扰技术 136
一、RNAi现象的发现 136
二、RNAi的作用机制 137
三、RNAi技术中的关键问题 137
四、RNAi技术的应用 139
思考题 139
主要参考文献 140
第八章 PCR技术及其应用 141
第一节 PCR技术原理和工作方式 141
一、PCR的基本原理 141
二、PCR反应体系 142
三、PCR反应程序 145
第二节 PCR产物的克隆 146
一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点 147
二、A/T克隆法 147
三、平末端DNA片段的克隆 148
四、长片段DNA的PCR扩增 149
第三节 PCR扩增未知DNA片段 151
一、反向PCR 151
二、利用接头的PCR 151
三、热不对称交错PCR 153
第四节 与反转录相关的PCR 154
一、cDNA末端的快速扩增 154
二、差异显示PCR 155
第五节 PCR产生DNA指纹 157
一、多重PCR 158
二、随机扩增多态性DNA 158
三、扩增片段长度多态性 158
第六节 实时定量PCR 159
一、实时荧光定量PCR的定量方式 159
二、荧光标记方式 160
思考题 162
主要参考文献 162
第九章 DNA序列分析 164
第一节 第一代DNA测序技术 164
一、Maxam-Gilbert化学降解法测序技术 164
二、Sanger双脱氧链终止法 166
第二节 第二代测序技术 171
一、454测序技术 171
二、Solexa测序技术 172
三、SOLiD测序技术 174
四、离子肼测序技术 177
第三节 单分子测序技术 177
一、Heliscope单分子测序技术 178
二、SMRT单分子测序技术 178
三、纳米孔单分子测序技术 178
四、现代测序技术的发展趋势和展望 179
第四节 DNA片段序列测定的策略 180
一、通用引物指导未知序列的测定 180
二、引物步移 180
三、随机克隆测序 180
四、缺失克隆测序 181
第五节 转录组测序 182
一、RNA-seq技术简介 182
二、mRNA-Seq技术流程 182
三、mRNA的富集 182
四、mRNA的测序 184
第六节 核苷酸序列的生物信息分析 184
一、序列分析和生物信息学的应用 185
二、基因数据库和分析工具 185
思考题 186
主要参考文献 186
第十章 DNA诱变 188
第一节 随机诱变 188
一、错误掺入诱变 189
二、盒式诱变 190
三、增变菌株的诱变作用 191
四、化学诱变 191
第二节 DNA体外重组 192
一、DNA洗牌法 193
二、交错延伸重组 193
三、随机引发重组 194
第三节 寡核苷酸介导的定点诱变 195
一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程 196
二、诱变寡核苷酸的设计 196
三、不依赖于PCR的DNA定点诱变 196
四、PCR介导的定点诱变 199
第四节 嵌套缺失 204
一、嵌套缺失的制备 205
二、嵌套缺失的应用 206
思考题 207
主要参考文献 207
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选 209
第一节 基因组DNA文库的构建 210
一、基因组DNA文库的类型和发展 210
二、文库的代表性和随机性 211
三、基因组DNA文库的构建流程 212
第二节 cDNA文库的构建 212
一、cDNA文库的特征和发展 212
二、cDNA文库的构建 213
三、cDNA文库均一化处理 218
四、扣除杂交cDNA文库 218
五、全长cDNA文库 221
六、其他cDNA文库 222
第三节 基因克隆的筛选策略 224
一、表型筛选法 225
二、杂交筛选和PCR筛选 225
三、免疫筛选 225
四、酵母双杂交系统 226
五、克隆基因的验证和分析 226
第四节 DNA文库的保存 227
思考题 227
主要参考文献 228
第十二章 基因组研究技术 229
第一节 传统基因组研究技术 229
一、基因组遗传图谱的构建 230
二、基因组物理图谱的构建 231
三、基因组测序 234
第二节 现代基因组研究技术 241
一、基因组序列的解读 242
二、基因功能的预测和验证 244
三、功能基因组学研究技术 245
第三节 基因组工程 250
一、基因工程与基因组工程 250
二、基因组工程研究中的遗传同源重组系统 251
思考题 256
主要参考文献 257
第二篇 基因工程应用 261
第十三章 植物基因工程 261
第一节 植物基因工程的发展现状 261
第二节 植物基因工程方法 263
一、原生质体介导法 263
二、基因枪法 265
三、根癌农杆菌介导法 267
四、基因枪法与根癌农杆菌介导法的比较 272
五、植物基因工程新技术 272
第三节 转化子细胞的筛选 272
一、植物基因工程中的选择基因 273
二、报告基因 273
第四节 转化体的鉴定与证实 274
一、PCR检测外源基因的整合 275
二、Southern杂交检测外源基因的整合 275
三、RT-PCR检测外源基因的表达 275
四、Northern杂交检测外源基因的表达 275
五、Real-time PCR实时荧光定量PCR检测外源基因的表达 276
六、Western杂交检测外源基因表达的产物 276
第五节 植物基因工程研究的应用和展望 276
一、抗性基因工程 276
二、植物品质改良基因工程 279
三、植物杂种优势的利用 280
四、植物代谢工程 280
五、生物反应器 280
六、复合性状 281
七、筛选标记基因的去除 281
思考题 282
主要参考文献 282
第十四章 动物基因工程 283
第一节 动物基因工程的发展现状与趋势 283
一、精细与安全的动物遗传修饰新技术 284
二、转基因动物将成为有限自然资源高效利用的主力军 285
第二节 动物转基因技术 285
一、动物基因工程载体 285
二、载体相关调控元件 293
三、基因转移技术 294
第三节 转基因动物制备 297
一、转基因动物的制备方法 297
第四节 转基因动物鉴定与安全评价 300
一、外源基因的基因组水平鉴定 300
二、转基因动物中外源基因表达水平检测 301
三、转基因动物中目标基因的蛋白水平测定 301
四、转基因动物传代与检测 302
五、转基因动物及其产品的安全性评价 302
第五节 转基因动物的应用与展望 303
一、转基因动物的应用 303
二、转基因动物的展望 305
思考题 305
主要参考文献 305
第十五章 酵母基因工程 307
第一节 酵母基因工程的发展现状和发展趋势 307
一、酵母基因工程的优点 307
二、酵母基因工程的发展现状 308
三、酵母基因工程的发展趋势 309
第二节 酵母表达系统 311
一、酵母表达系统概述 311
二、常用酵母表达系统 313
第三节 酵母基因工程的应用 319
一、酵母基因工程的应用情况 319
二、酵母基因工程的应用举例 321
思考题 323
主要参考文献 323
第十六章 细菌基因工程 325
第一节 细菌基因工程的发展现状和发展趋势 325
一、细菌基因工程的发展简史 325
二、细菌基因工程的发展现状 325
三、细菌基因工程的发展趋势及前景展望 327
第二节 细菌基因工程的表达系统 327
一、细菌基因工程的表达系统 327
二、表达载体构建原则 328
三、外源基因表达的方式 328
四、常见细菌表达系统 329
第三节 细菌基因工程的应用 332
一、农业领域的基因工程细菌 332
二、食品和工业基因工程菌 336
三、重组DNA技术生产医用抗生素 339
四、环境微生物基因工程菌的应用 342
思考题 346
主要参考文献 346
第十七章 病毒基因工程 348
第一节 病毒载体 349
一、动物病毒载体 349
二、植物病毒载体 358
三、噬菌体载体 358
第二节 病毒与基因工程 359
一、基因工程病毒疫苗 359
二、病毒与基因治疗 362
三、溶瘤病毒与癌症治疗 363
四、病毒与生物防治 364
思考题 368
主要参考文献 369
第十八章 医药基因工程 370
第一节 基因工程药物的开发现状与发展趋势 371
一、基因工程药物的种类 371
二、基因工程药物的产业化状况 372
三、基因工程药物的发展趋势 372
第二节 基因工程蛋白和多肽药物 374
一、基因工程胰岛素 375
二、基因工程人红细胞生成素 376
三、基因工程干扰素 377
四、基因工程疫苗 378
五、基因工程抗体 380
第三节 基因工程抗体 380
一、抗体的结构 380
二、天然抗体的局限性 381
三、基因工程抗体的种类 382
第四节 基因工程核酸类药物 385
一、反义核酸药物 386
二、核酸疫苗 388
三、RNA干扰 389
四、基因治疗 390
思考题 392
主要参考文献 392
第十九章 基因工程产品的安全评价及其管理 393
第一节 基因工程产品的安全评价 393
一、DNA重组生物安全准则 393
二、转基因生物产品的安全评价原则 393
第二节 基因工程产品的安全性管理类型 394
第三节 基因工程技术安全性探讨及其产品的发展前景 396
附录 转基因农作物产品的安全性争论事件 398
一、食用安全争议事件 398
二、生态安全事例 399
思考题 400
主要参考文献 400
索引 401