第一篇 花生脂肪酸代谢的遗传调控与基因工程 3
第一章 植物脂肪酸代谢的遗传调控与基因工程 3
1.1 脂肪酸的种类及其重要性 3
1.1.1 脂肪酸的种类 3
1.1.2 植物脂肪酸的生理功能 4
1.1.3 植物脂肪酸的食用及工业价值 4
1.2 脂肪酸生物代谢途径与调控 5
1.2.1 脂肪酸生物代谢途径 5
1.2.2 植物脂肪酸代谢调控的基因工程 6
第二章 植物脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究进展 11
2.1 脂肪酸脱氢酶的种类与分布 11
2.1.1 植物脂酰ACP脱氢酶 12
2.1.2 植物脂酰-脂脱氢酶 13
2.2 脂肪酸脱氢酶的克隆与序列分析 14
2.3 脂肪酸脱氢酶的催化机理与活性中心 17
第三章 RNAi在植物遗传改良中的应用 19
3.1 植物的转基因沉默 19
3.2 RNAi的产生机制 20
3.3 RNAi在植物遗传改良中的应用 22
3.3.1 植物的功能基因组学研究 22
3.3.2 植物品质的遗传改良 24
第四章 花生脂肪酸脱氢酶基因研究进展 27
4.1 油酸脱氢酶基因 27
4.2 油酸脱氢酶基因的调控表达 28
4.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC） 30
第五章 花生遗传转化和再生研究进展 33
5.1 花生遗传转化的目的和意义 33
5.2 农杆菌介导的转化 34
5.3 基因枪介导的转化 39
第二篇 花生基因工程实验技术 45
第六章 花生总DNA提取 45
6.1 目的 45
6.2 材料 45
6.3 DNA粗提液微量制备 45
6.3.1 试剂 45
6.3.2 操作 46
6.4 DNA提取与纯化 46
6.4.1 试剂 46
6.4.2 操作步骤 46
第七章 花生总RNA提取 48
7.1 目的 48
7.2 材料 48
7.3 一步提取法 48
7.3.1 试剂 48
7.3.2 操作步骤 49
7.4 通用的方法 50
7.4.1 试剂 50
7.4.2 操作 50
第八章 质粒DNA的提取与酶切 52
8.1 目的 52
8.2 试剂 52
8.3 操作步骤 52
第九章 核酸提取物纯度及浓度检测 55
9.1 目的 55
9.2 材料 55
9.3 分光光度计法 55
9.3.1 操作 55
9.4 琼脂糖凝胶电泳法 56
9.4.1 试剂 56
9.4.2 操作 57
第十章 目的基因的PCR扩增 59
10.1 目的 59
10.2 材料 59
10.3 操作 59
第十一章 cDNA文库构建 61
11.1 目的 61
11.2 材料 61
11.3 试剂 61
11.4 操作 62
第十二章 农杆菌法转化外源基因 65
12.1 目的 65
12.2 材料 65
12.3 实验步骤 65
第十三章 基因枪法转化外源基因 67
13.1 目的 67
13.2 材料 67
13.3 操作 67
第十四章 组织化学染色法检测GUS活性 70
14.1 目的 70
14.2 材料 70
14.3 试剂 70
14.4 操作步骤 71
第十五章 Southern-Blot 73
15.1 目的 73
15.2 试剂 73
15.3 操作步骤 74
15.3.1 基因组DNA的限制酶切 74
15.3.2 DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳 74
15.3.3 DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 74
15.3.4 探针标记 76
15.3.5 杂交 77
15.3.6 洗膜与检测 77
15.3.7 放射自显影 78
第十六章 Northern印迹杂交 79
16.1 目的 79
16.2 材料 79
16.3 总RNA或mRNA琼脂糖凝胶电泳分离 79
16.3.1 试剂 79
16.3.2 操作 80
16.4 印迹 81
16.4.1 操作 81
16.5 RNA杂交和显影 81
第十七章 外源基因表达的RT-PCR检测 83
17.1 目的 83
17.2 试剂 83
17.3 操作 83
第十八章 外源基因整合的原位杂交 85
18.1 目的 85
18.2 材料 85
18.3 试剂 85
18.4 操作 86
第三篇 花生油酸脱氢酶基因研究成果 91
第十九章 花生属脂肪酸脱氢酶基因的克隆和序列分析 91
19.1 材料和方法 92
19.1.1 试验材料 92
19.1.2 RNA提取与RT-PCR扩增 92
19.1.3 目的基因片段的克隆与序列测定 94
19.1.4 分子系统发育树的分析 99
19.2 结果与分析 99
19.2.1 花生属FAD2基因的克隆和序列测定 99
19.2.2 花生属FAD2基因的序列比较与蛋白分析 100
19.2.3 花生属FAD2基因的系统进化关系 102
19.3 讨论 102
第二十章 花生油酸脱氢酶基因高效表达载体构建与原核表达 109
20.1 材料与方法 110
20.1.1 菌株与质粒 110
20.1.2 酶及试剂 110
20.1.3 培养基 110
20.1.4 表达载体构建与转化 110
20.1.5 外源蛋白的诱导表达 111
20.1.6 重组蛋白的提取 112
20.1.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 112
20.1.8 重组蛋白的纯化 114
20.1.9 FAD2活性测定与脂肪酸GC-MS分析 114
20.2 结果与分析 115
20.2.1 高效表达载体构建 115
20.2.2 目的基因在大肠杆菌中的蛋白表达SDS-PAGE分析与纯化 115
20.2.3 重组蛋白的功能鉴定 117
20.3 讨论 118
20.3.1 表达载体与受菌体的选择 118
20.3.2 培养条件的优化 119
20.3.3 影响脂肪酸脱氢酶表达的其他因素与途径 120
第二十一章 花生油酸脱氢酶在酿酒酵母中的表达和功能鉴定 121
21.1 材料和方法 122
21.1.1 菌株与质粒 122
21.1.2 主要试剂 122
21.1.3 培养基 122
21.1.4 含油酸脱氢酶的表达载体pYES/HO-A的构建 124
21.1.5 重组质粒在酿酒酵母中的诱导表达 125
21.1.6 重组蛋白的检测 126
21.1.7 酵母油脂的脂肪酸分析 128
21.2 结果与分析 128
21.2.1 重组表达质粒pYES/HO-A的构建和酶切鉴定 128
21.2.2 油酸脱氢酶在酿酒酵母中的诱导表达 128
21.2.3 酵母油脂的脂肪酸分析 129
21.3 讨论 131
第二十二章 花生FAD2基因特异表达载体的构建和RNAi对内源基因表达的抑制作用 134
22.1 材料与方法 135
22.1.1 植物材料 135
22.1.2 菌种与质粒 136
22.1.3 酶与试剂 136
22.1.4 培养基 136
22.1.5 PCR引物 137
22.1.6 特异表达载体的构建 137
22.1.7 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备 139
22.1.8 冻融法直接转化LBA4404 140
22.1.9 菌落PCR 140
22.1.10 农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立 141
22.1.11 转基因花生的分子生物检测 142
22.2 结果与分析 143
22.2.1 构建FAD2基因反向重复序列表达载体 143
22.2.2 建立转化再生体系及筛选Km抗性浓度 145
22.2.3 转基因植株的获得 147
22.2.4 转化植株的PCR检测 148
22.2.5 Real Time PCR检测目的基因的表达 149
22.3 讨论 152
22.3.1 关于影响农杆菌介导花生遗传转化的因素 152
22.3.2 RNA干扰（RNAi）技术在植物基因工程中的应用 153
22.3.3 实时荧光定量PCR在基因表达方面的应用 153
参考文献 155