第1章 药用石斛资源及其可持续利用现状 1
1．药用石斛应用及其资源现状 1
2．药用石斛资源再生现状 7
2.1 药用石斛的野生变家种 9
2.2 药用石斛的组织培养 9
3．药用石斛化学成分及药理作用 12
4．课题构想 16
第2章 霍山石斛类原球茎组织培养系的建立 33
1．实验材料 33
1.1 主要试剂 33
1.2 主要仪器 34
2．实验方法 35
2.1 霍山石斛无菌苗的诱导 35
2.2 霍山石斛类原球茎的诱导 35
2.3 类原球茎增殖 35
2.4 霍山石斛类原球茎长期继代培养的品质稳定性考察 35
2.5 数据统计 39
3．实验结果 39
3.1 霍山石斛类原球茎的诱导 39
3.2 霍山石斛类原球茎的增殖 41
3.3 霍山石斛类原球茎的品质稳定性分析 42
4．讨论 45
第3章 霍山石斛多糖增强机体免疫功能的研究 53
1．实验材料 53
1.1 霍山石斛 53
1.2 实验动物 53
1.3 主要试剂 54
1.4 主要仪器 54
2．实验方法 55
2.1 HPS的提取及含量测定 55
2.2 HPS的DEAE—Cellulose分级分离 55
2.3 RPMI—1640培养液配制方法 55
2.4 HBSS液的配制 55
2.5 脾细胞悬液的制备 56
2.6 腹腔巨噬细胞悬液的制备 56
2.7 HPS联合Con A 诱导小鼠脾细胞产生IFN—γ 57
2.8 HPS联合LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF—α 57
2.9 总RNA的提取 57
2.1 0 RT—PCR 58
2.1 1统计分析 58
3．实验结果 59
3.1 霍山石斛HPS的提取和蛋白脱除 59
3.2 野生霍山石斛HPS对小鼠脾细胞产生IFN—γ的影响 59
3.3 野生霍山石斛HPS对小鼠脾细胞IFN—γ mRNA表达的影响 60
3.4 野生霍山石斛HPS对小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF—α的影响 61
3.5 野生霍山石斛HPS对小鼠腹腔巨噬细胞TNF—α mRNA表达的影响 61
3.6 野生霍山石斛HPS不同组分的活性 61
3.7 野生霍山石斛多糖与类原球茎多糖组分及生物学活性比较 63
4．讨论 64
第4章 霍山石斛类原球茎液体培养碳氮代谢分析 69
1．实验材料 69
1.1 霍山石斛类原球茎 69
1.2 主要试剂 70
1.3 主要仪器 70
2．实验方法 70
2.1 类原球茎悬浮培养与生长的测定 70
2.2 多糖提取和含量测定 71
2.3 可溶性糖含量的测定 71
2.4 蔗糖磷酸合成酶（SPS，EC 2.4.1.1 4）、蔗糖合成酶（SuSy，EC 2.4.1.1 3）和蔗糖酶（IT，EC 3.2.1.2 6）活性的测定 71
2.5 可溶性离子NH？、NO？的含量测定 72
2.6 硝酸还原酶（NR，EC 1.6.6.1 ）、谷氨酸合酶（GOGAT，EC 1.4.1.1 4）和谷氨酰胺合成酶（GS，EC 6.3.1.2 ）活性的测定 73
2.7 实验参数 74
3．实验结果 74
3.1 霍山石斛类原球茎的生长动态进程 74
3.2 pH的动态变化 76
3.3 胞内、胞外糖消耗的动态进程 76
3.4 碳源代谢关键酶活性的动态变化 77
3.5 胞内、胞外NH？和NO？消耗的动态进程 77
3.6 氮源代谢相关酶活性的动态变化 79
4．讨论 80
第5章 霍山石斛类原球茎生长和多糖合成调控 87
1．实验材料 87
1.1 霍山石斛类原球茎 87
1.2 主要试剂 87
1.3 主要仪器 88
2．实验方法 88
2.1 类原球茎悬浮培养与生长的测定 88
2.2 生长培养基优化方案设计 88
2.3 多糖合成调节方案设计 88
2.4 多糖提取与含量测定 89
2.5 可溶性糖含量的测定 89
2.6 霍山石斛多糖的DEAE—Cellulose分级分离与含量测定 89
2.7 霍山石斛类原球茎多糖的生物学活性评价 89
2.8 实验参数 89
3．实验结果 90
3.1 类原球茎生长培养基的优化 90
3.2 HPS合成的调控 94
3.3 优化和调控条件下的HPS组分及生物活性评价 98
4．讨论 98
第6章 霍山石斛活性多糖的分离纯化及结构表征 106
1．实验材料 107
1.1 霍山石斛类原球茎 107
1.2 主要试剂 107
1.3 主要仪器 108
2．实验方法 108
2.1 HPS的提取和DEAE—Cellulose分级分离 108
2.2 HPS—1的凝胶渗透色谱纯化 109
2.3 多糖组分活性测定 109
2.4 多糖的纯度及摩尔分子量测定 110
2.5 HPS—1B23的比旋光度的测定 110
2.6 HPS—1B23的扫描电镜观察 110
2.7 刚果红实验 110
2.8 紫外光谱分析 111
2.9 HPS—1B23单糖组成成分分析 111
2.1 0红外光谱分析 111
2.1 1 高碘酸氧化反应 111
2.1 2 Smith降解反应 112
2.1 3 多糖甲基化分析 112
2.1 4 多糖的部分酸水解分析 113
2.1 5 多糖的核磁共振波谱分析 113
3．实验结果 113
3.1 霍山石斛多糖的凝胶柱色谱分离纯化 113
3.2 类原球茎多糖HPS—1B23纯度和分子量鉴定 117
3.3 类原球茎多糖HPS—1B23比旋光度的测定 118
3.4 类原球茎多糖HPS—1B23的表观形态学观察 118
3.5 刚果红实验分析 118
3.6 类原球茎多糖HPS—1B23紫外光谱分析 118
3.7 类原球茎多糖HPS—1B23单糖组成成分分析 121
3.8 类原球茎多糖HPS—1B23红外光谱分析 123
3.9 类原球茎多糖HPS—1B23相邻单糖连接方式的分析 124
4．讨论 135
第7章 结论 140