第一章 文献综述 1
第一节 植物抗逆性及研究意义 1
一、逆境与植物抗逆性 1
二、研究植物抗逆性的意义 2
第二节 低温胁迫对植物的影响及研究意义 3
一、低温胁迫 3
二、低温胁迫对植物生长发育的影响 3
第三节 植物的抗寒机理及研究进展 5
一、冷驯化（cold acclimation） 6
二、膜结构的稳定与抗寒性 6
三、渗透调节物质 9
四、植物的抗氧化保护系统 9
五、细胞酶系 10
六、冷诱导基因（COR） 11
第四节 植物抗寒基因与抗寒性改良的研究 12
一、编码功能性蛋白的基因 13
二、编码调控性蛋白的基因 18
三、CBF和ICE转录因子基因对植物抗寒性的改良 37
第五节 桃的冷害和抗冷性研究 38
一、桃概述 38
二、低温对桃树生长发育的影响 39
第六节 本研究的目的和意义 41
第二章 桃CBF和ICE转录因子基因的克隆和序列分析 43
第一节 引言 43
第二节 试验材料、试剂和仪器 45
一、试验材料 45
二、试验所需的菌株、载体和感受态细胞 45
三、主要化学试剂 46
四、主要仪器设备 46
第三节 试验方法 47
一、桃基因组DNA和总RNA的提取与检测 47
二、PCR扩增及其产物的检测 50
三、目的片段的回收与检测 52
四、克隆片段的连接和转化及测序 53
五、CBF基因的酵母单杂交 57
第四节 结果与分析 60
一、桃基因组DNA和总RNA的检测结果 60
二、桃CBF基因和ICE基因的克隆 61
三、桃树CBF基因的生物信息学分析 66
四、桃ICE基因的信息学分析 72
五、酵母单杂交 82
第五节 小结与讨论 86
一、桃的核酸提取 86
二、CBF和ICE基因的克隆 87
三、CBF基因的序列分析 88
四、ICE基因的序列分析 88
五、酵母单杂交 89
第三章 桃CBF和ICE基因的烟草转化 90
第一节 引言 90
第二节 试验材料与仪器 92
一、试验材料 92
二、主要化学试剂 92
三、主要仪器设备 93
第三节 试验方法 93
一、P3301.PpCBF和UN.ICE表达载体构建 93
二、农杆菌工程菌的获得与鉴定 98
三、表达载体对烟草的转化 100
第四节 结果与分析 103
一、表达载体的构建 103
二、过表达转桃CBF基因、ICE基因烟草的创制 105
第五节 小结 108
一、外源基因转入不同物种所需载体不同，不同基因转入同一物种也存在过表达载体的选择问题 108
二、转基因过程中的污染问题 108
第四章 转桃CBF基因烟草耐逆性分析 109
第一节 引言 109
第二节 试验材料和仪器 111
一、试验材料 111
二、主要化学试剂 111
三、主要仪器设备 112
第三节 试验方法 112
一、转CBF基因烟草的分子鉴定 112
二、转CBF基因烟草苗期抗逆性研究 113
三、转CBF基因烟草苗期与抗性相关的生理生化指标的检测 114
第四节 结果与分析 121
一、过表达CBF转基因烟草的分子鉴定结果 121
二、转CBF基因烟草阳性植株的逆境胁迫结果 122
第五节 小结与讨论 142
一、转CBF基因烟草的分子鉴定 142
二、转桃CBF基因与非转基因烟草植株在逆境胁迫下的表型变化 143
三、转桃CBF基因比非转基因烟草植株矮小 143
四、转桃CBF基因与对照株在逆境胁迫下的丙二醛和电导度变化 144
五、转桃CBF基因与非转基因烟草植株在逆境胁迫下的SOD酶和POD酶活性变化 145
六、转桃CBF基因与非转基因烟草植株在逆境胁迫下的可溶性糖和脯氨酸含量的变化 147
第五章 转CBF基因烟草的FAD和ERDB两基因的表达分析 150
第一节 引言 150
第二节 试验材料和仪器 150
一、试验材料 150
二、主要化学试剂和仪器 150
第三节 试验方法 151
一、不同处理下烟草叶片的总RNA提取 151
二、RNA的质量检测与RT-PCR 151
三、FAD和ERDB两基因在逆境下的应答表达分析 151
第四节 结果与分析 152
一、低温胁迫下转CBF基因烟草与非转基因烟草的FAD和ERDB基因的表达 152
二、干旱胁迫下转CBF基因烟草与非转基因烟草的FAD和ERDB基因的表达 153
三、盐胁迫下转CBF基因烟草与非转基因烟草的FAD和ERDB基因的表达 154
第五节 小结与讨论 155
第六章 研究结果与展望 156
参考文献 158
附录 186
附录一 本实验所需培养基的配方 186
附录二 试验中所用的引物及序列 188
附录三 pCMBLA3301.CBF表达载体的构建图谱 189
附录四 UN.ICE表达载体的构建图谱 190
附录五 转基因烟草转化过程 191
附录六 冷胁迫下转CBF基因植株与非转基因植株的表型变化 192
附录七 干旱胁迫下转CBF基因植株与非转基因植株的表型变化 193
缩略词表 194