第1章 如何在分子水平研究生命 1
1.1 生物化学与分子生物学实验技术的发展简史 1
1.2 生物化学与分子生物学实验技术的完整体系 4
1.2.1 对生物分子进行分析鉴定 4
1.2.2 对生物分子进行人工合成 4
1.2.3 对生物分子进行人工改造 5
1.2.4 对生物分子进行功能研究 6
1.3 生物化学与分子生物学实验技术的广泛应用 6
1.3.1 电泳技术在临床检验中的应用 7
1.3.2 DNA重组技术在医药卫生领域的扩展 7
1.3.3 基因诊断和治疗技术在未来医学领域的前景 8
1.3.4 动物模型在医学研究中的重要地位 8
第2章 从组织中分离纯化生物高分子——高分子制备技术 10
2.1 预处理和细胞的分离 11
2.1.1 选择材料及预处理 11
2.1.2 细胞的分离 11
2.2 细胞破碎及细胞器分离 11
2.2.1 细胞破碎 11
2.2.2 细胞器的分离 13
2.3 分离与纯化 13
2.3.1 蛋白质的分离纯化 13
2.3.2 核酸的分离纯化 14
2.3.3 蛋白质浓度的测定 15
2.3.4 核酸的浓度、纯度测定和完整性鉴定 17
2.4 生物高分子提纯后的处理 18
2.4.1 样品的浓缩 18
2.4.2 样品的干燥 18
2.4.3 样品的保存 19
2.5 实验项目——蛋白质的盐析与透析 20
第3章 测定物质的吸收光谱——分光光度技术 22
3.1 分光光度技术的基本原理 22
3.1.1 光的性质 22
3.1.2 光谱 23
3.1.3 Lambert-Beer定律 24
3.2 分光光度计的基本结构 25
3.2.1 光源 26
3.2.2 分光系统 26
3.2.3 样品室 27
3.2.4 检测器 27
3.2.5 显示器 28
3.3 常用分光光度计的使用方法 28
3.3.1 721e型分光光度计 28
3.3.2 722s型分光光度计 28
3.3.3 Sp-756紫外可见分光光度计 29
3.4 分光光度技术的应用 29
3.4.1 溶液的定性分析 29
3.4.2 溶液的定量分析 30
3.5 实验项目 30
3.5.1 蛋白质的定量测定 30
3.5.2 脲酶Km值测定 34
3.5.3 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（赖氏法） 36
3.5.4 血糖的定量测定——葡萄糖氧化酶法 39
3.5.5 激素对血糖浓度变化的影响 40
3.5.6 血浆高密度脂蛋白-胆固醇的测定 41
3.5.7 紫外分光光度法检测核酸的浓度及纯度 43
第4章 将混合物中各种组分分开——层析技术 44
4.1 层析技术的形成和发展 44
4.2 层析技术概述 45
4.2.1 层析技术的基本原理 45
4.2.2 层析技术的分类 45
4.2.3 层析技术的基本要求 46
4.3 吸附层析 46
4.3.1 吸附层析的原理 46
4.3.2 吸附层析的操作 46
4.4 分配层析 48
4.4.1 纸层析的原理 48
4.4.2 纸层析的操作 49
4.5 凝胶过滤层析 50
4.5.1 凝胶过滤层析的原理 50
4.5.2 凝胶过滤层析的特征常数 51
4.5.3 凝胶过滤层析的常用介质 51
4.5.4 凝胶过滤层析的操作 52
4.5.5 凝胶过滤层析的应用 53
4.6 离子交换层析 53
4.6.1 离子交换层析的原理 54
4.6.2 离子交换剂 54
4.6.3 离子交换层析的操作 55
4.6.4 离子交换层析的应用 57
4.7 亲和层析 57
4.7.1 亲和层析的原理 58
4.7.2 亲和层析的操作 58
4.8 实验项目 59
4.8.1 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 59
4.8.2 转氨酶的活性鉴定——薄层层析法 60
4.8.3 核苷酸的分离——离子交换柱层析法 62
4.8.4 胰蛋白酶的分离纯化——亲和层析法 63
4.8.5 血清蛋白质的层析分离——分子筛层析法 64
第5章 分离带电粒子的有效手段——电泳技术 66
5.1 电泳技术的形成和发展 66
5.2 电泳技术的基本原理 66
5.3 影响泳动率的因素 67
5.3.1 溶液的pH 67
5.3.2 缓冲液的离子强度 68
5.3.3 电场强度 68
5.3.4 电渗作用 69
5.4 电泳技术的种类 69
5.4.1 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 69
5.4.2 凝胶电泳 70
5.4.3 等电聚焦电泳 72
5.4.4 双向电泳 73
5.4.5 核酸电泳 74
5.4.6 印迹转移电泳 75
5.5 实验项目 76
5.5.1 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 76
5.5.2 血清乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳 78
5.5.3 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 79
5.5.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 80
5.5.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 83
5.5.6 限制性内切酶对质粒DNA酶切产物的电泳鉴定 84
第6章 利用离心场沉降高分子——离心技术 86
6.1 离心技术的基本原理 86
6.1.1 颗粒沉降的原理 86
6.1.2 沉降系数 87
6.1.3 相对离心力 87
6.2 离心机的类型和操作规程 87
6.2.1 离心机的类型 87
6.2.2 制备型离心机 88
6.2.3 分析型离心机 90
6.3 制备性超速离心的分离方法 90
6.3.1 差速沉降离心法 91
6.3.2 密度梯度区带离心法 91
6.3.3 等密度梯度区带离心法 91
6.4 离心机操作的注意事项 91
6.5 实验项目 92
6.5.1 肝糖原的提取和鉴定 92
6.5.2 酪蛋白的制备 94
6.5.3 动物肝脏DNA的提取 95
6.5.4 酵母RNA的提取及成分鉴定 96
6.5.5 质粒DNA的提取与鉴定 98
6.5.6 感受态细菌的制备及质粒DNA的转化 102
第7章 利用碱基互补探查核酸序列——分子杂交技术 105
7.1 核酸分子杂交的基本原理 105
7.1.1 变性与复性 105
7.1.2 建立在DNA变性与复性基础上的核酸杂交技术 106
7.2 核酸探针的分类和标记 107
7.2.1 核酸探针的分类 107
7.2.2 核酸探针的标记 108
7.3 核酸分子杂交技术 110
7.3.1 固相杂交的支持物 110
7.3.2 常用的转移方法 111
7.3.3 固相杂交的基本程序 111
7.4 主要的杂交类型 112
7.4.1 Southern杂交 112
7.4.2 Northern杂交 112
7.4.3 组织原位杂交 113
7.4.4 斑点杂交 113
7.5 实验项目 113
7.5.1 Southern杂交 113
7.5.2 Northern杂交 115
7.5.3 组织原位杂交 116
7.5.4 斑点杂交 118
第8章 微量DNA体外扩增——PCR技术 120
8.1 PCR技术的产生与发展 120
8.1.1 PCR技术的产生 120
8.1.2 PCR新技术的发展 121
8.2 PCR技术基础 123
8.2.1 PCR技术的基本原理 123
8.2.2 PCR技术的特点 124
8.2.3 PCR反应体系中的基本成分 124
8.2.4 PCR的反应参数 128
8.2.5 常规PCR反应 129
8.2.6 PCR反应条件的优化 130
8.2.7 PCR产物的检测分析 130
8.3 PCR技术的应用 131
8.3.1 PCR技术在分子生物学中的应用 131
8.3.2 PCR技术在传染病病原体检测中的应用 131
8.3.3 PCR技术在肿瘤相关基因检测的应用 132
8.3.4 PCR技术在遗传病早期诊断的应用 132
8.4 PCR的衍生技术 132
8.4.1 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 132
8.4.2 实时荧光定量PCR 136
8.5 实验项目——聚合酶链式反应（PCR）体外扩增DNA 142
第9章 阅读遗传天书的第一步——测序技术 145
9.1 DNA序列测定的基本原理 145
9.2 DNA测序方法 145
9.2.1 酶学法——双脱氧链终止法 146
9.2.2 化学（裂解）法——Maxam-Gilbert测序法 148
9.2.3 双脱氧测序法和化学测序法的选择 149
9.3 DNA测序自动化和大规模测序 151
第10章 建立转基因动物模型——转基因技术 153
10.1 转基因动物 154
10.2 转基因的原理和方法 155
10.2.1 转基因动物技术的基本体系 155
10.2.2 建立转基因动物的方法 155
10.3 基因敲除小鼠和基因敲入小鼠 162
10.3.1 基因敲除小鼠 162
10.3.2 基因敲入小鼠 162
10.4 转基因动物的应用 163
10.4.1 研究基因的结构和功能及其表达与调控 163
10.4.2 建立人类疾病动物模型 163
10.4.3 研究人类疾病基因治疗 163
10.4.4 利用转基因动物生产生物活性蛋白 164
10.4.5 利用转基因动物生产人用器官移植的供体 164
10.4.6 利用转基因技术改良动物品种和生产性能 164
10.5 转基因安全性问题 165
10.5.1 转基因生物的环境安全性 165
10.5.2 转基因食品的安全性 166
第11章 去除动物体内某种基因——基因敲除技术 167
11.1 基因敲除技术的建立和发展 167
11.2 基因敲除的原理和基本方法 168
11.3 基因敲除小鼠的制备过程 171
11.4 基因敲除的其他方法及进展 175
11.4.1 条件性基因敲除法 175
11.4.2 诱导性基因敲除法 176
11.4.3 利用随机插入突变进行基因敲除 177
11.5 基因敲除技术的应用及前景 179
11.5.1 建立生物模型 179
11.5.2 疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗 179
11.5.3 提供廉价的异种移植器官 179
11.5.4 免疫学中的应用 180
11.5.5 改造生物、培育新的生物品种 180
11.6 基因敲除技术的缺陷 180
第12章 21世纪的生命科学技术——蛋白质组学技术 181
12.1 蛋白质组学概论 181
12.2 蛋白质组学研究的策略和范围 183
12.3 蛋白质组学的技术 183
12.3.1 蛋白质组研究中的样品制备 184
12.3.2 蛋白质组研究中的样品分离技术 185
12.3.3 蛋白质组研究中的样品鉴定技术 190
12.4 蛋白质组生物信息学 196
12.5 蛋白质组学发展趋势 196
12.6 实验项目 197
12.6.1 家兔血清蛋白质组二维凝胶电泳技术的建立 197
12.6.2 正常人尿蛋白质组学研究 198
第13章 蛋白质与核酸相互作用分析——EMSA和ChIP技术 200
13.1 电泳迁移阻滞实验的基本原理 200
13.2 染色质免疫沉淀技术的基本原理 200
13.3 EMSA的基本操作步骤 201
13.3.1 探针的选择 201
13.3.2 探针的标记与纯化 201
13.3.3 核酸结合蛋白的制备 202
13.3.4 蛋白质与寡核苷酸探针的结合反应 202
13.3.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 202
13.3.6 预电泳和电泳 202
13.3.7 检测 203
13.4 ChIP技术的基本操作步骤 203
13.4.1 蛋白质与DNA交联 203
13.4.2 染色质DNA的剪切 203
13.4.3 免疫沉淀 203
13.4.4 洗脱和纯化与蛋白结合的DNA 204
13.4.5 DNA分析 204
13.5 实验项目 204
13.5.1 经EMSA验证姜黄素可减少B淋巴细胞核中NF-kB的量 204
13.5.2 经ChIP验证姜黄素可减少B淋巴细胞核中NF-kB的量 207
第14章 蛋白质和蛋白质相互作用分析——酵母双杂交等技术 211
14.1 概述 211
14.1.1 相互作用蛋白质组学 211
14.1.2 相互作用蛋白质组学的研究目标 212
14.1.3 相互作用蛋白质组学的研究内容和主要技术 213
14.2 酵母双杂交技术 214
14.2.1 酵母双杂交系统的原理 214
14.2.2 酵母双杂交系统的应用 215
14.2.3 酵母细胞内的高通量酵母双杂交 215
14.2.4 酵母双杂交系统的几个版本 216
14.2.5 酵母双杂交系统的假阳性问题 216
14.3 其他常用技术 216
14.3.1 细菌双杂交系统 216
14.3.2 噬菌体展示技术 218
14.3.3 依赖于亲和力筛选相互作用蛋白质的方法 218
14.3.4 蛋白质芯片技术 219
14.4 实验项目 219
14.4.1 经酵母双杂交技术筛选TRAC-1相互作用蛋白质 219
14.4.2 GST融合蛋白沉降技术筛选RNF114相互作用蛋白质 225
第15章 科学发展的不竭源泉——技术创新 228
15.1 “三性”实验 228
15.1.1 “三性”实验的概念 228
15.1.2 “三性”实验的特点和意义 228
15.1.3 实验教学体系的改革 229
15.1.4 “三性”实验基本要求 230
15.1.5 “三性”实验的一般程序 230
15.1.6 “三性”实验选题原则要求 230
15.1.7 “三性”实验的评估及实施 231
15.2 实验项目 231
15.2.1 酵母蔗糖酶的纯化及性质研究 231
15.2.2 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 237
15.2.3 DNA重组实验 240
第16章 确保实验技术的最佳效果——实验室管理 248
16.1 实验室规则 248
16.2 实验用品的清洗 249
16.2.1 玻璃仪器的洗涤 249
16.2.2 塑料器皿的洗涤 250
16.2.3 实验器皿的干燥与消毒 250
16.2.4 常用洗涤液及其配制 250
16.3 实验标本的制备 251
16.3.1 血液样品的制备和保存 251
16.3.2 尿液标本的收集与保存 252
16.3.3 组织样品的制备与保存 252
16.4 实验仪器的使用 253
16.4.1 刻度吸管的使用 253
16.4.2 微量进样器的使用 253
16.4.3 单道可调式移液器的使用 254
16.4.4 蒸汽压力灭菌器的使用 254
16.4.5 酸度计的使用 255
16.4.6 干燥箱和恒温箱的使用 256
16.4.7 电热恒温水浴锅的使用 257
16.5 实验数据的处理 257
16.5.1 列表法 258
16.5.2 作图法 258
16.5.3 少量实验数据的处理 259
16.5.4 实验误差和提高实验准确度的方法 259
16.6 实验报告的书写 261
16.6.1 实验记录 261
16.6.2 实验报告 261
16.7 常用实验数据 262
16.7.1 一般化学试剂的分级及配制的注意事项 262
16.7.2 实验室中常用酸碱的比重和浓度 264
16.7.3 常用缓冲溶液 264
16.7.4 溴化乙锭溶液的净化处理 270
16.7.5 离心机转数（r/min）与相对离心力（RCF）的换算 271
16.7.6 硫酸铵饱和度的常用表 271
16.7.7 元素原子量表 273
参考文献 275