目 录 1
序 1
前言 1
第1章定向分子进化的思想、概念和原理 1
1.1引言 1
1.2体内进化 2
1.3体外进化 4
1.4in silico进化 8
参考文献 9
第2章定向分子进化的基本策略和方法 11
2.1引言 11
2.2基本策略 11
2.3基本方法 12
2.3.1易错PCR 12
2.3.2 DNA改组和族改组 13
2.3.3外显子改组 16
2.3.4合成改组 16
2.3.5体外随机引发重组 17
2.3.6交错延伸 18
2.4非同源基因改组 19
2.4.1过渡模板随机嵌合 19
2.3.7酶法体外随机－定位诱变 19
2.4.2增长截短 20
2.4.3非顺序同源蛋白质重组 22
2.4.4合理设计与随机组合方法 22
2.4.5模块组装 24
2.4.6任意数量的碱基随机插入和缺失 26
2.4.8设计的寡核苷酸组装 28
2.4.7片段突变 28
2.4.9体外区室化 31
参考文献 31
第3章定向分子进化的选择／筛选策略和方法 34
3.1引言 34
3.2核糖体和mRNA展示技术 36
3.3噬菌体展示技术 39
3.3.1噬菌体展示作为酶库筛选的工具 39
3.3.2噬菌体－酶 43
3.3.3噬菌体－酶的选择 44
3.4酵母表面展示系统 57
3.5酵母n－杂交系统 59
3.5.1酵母双杂交检验 59
3.5.2酵母双杂交系统 61
3.6细菌双杂交（B2H）系统 66
3.7蛋白质互补检验 67
3.8.4蛋白质－小分子相互作用 68
3.8.3蛋白质－RNA相互作用 68
3.8.2蛋白质－DNA相互作用 68
3.8.1蛋白质－蛋白质相互作用 68
3.8酵母n－杂交系统的应用 68
3.9环境库的构建和筛选 69
参考文献 73
第4章核酶和脱氧核酶定向分子进化 76
4.1 引言 76
4.2核酶 81
4.2.1锤头型核酶 81
4.2.3蛋白质－RNA复合酶（RNaseP） 84
4.2 2发夹型核酶 84
4.2.4组Ⅰ内含子和组Ⅱ内含子 86
4.2.5环状核酶 87
4.3脱氧核酶 89
4.3.1 10-23结构脱氧核酶 90
4.3.2 8-17结构脱氧核酶 90
4.3.3手枪型结构脱氧核酶 91
4.3.4 “二分”型结构脱氧核酶 91
4.3.5环状结构脱氧核酶 92
4.4.1拓展核酸顺序空间的新方法 93
4.4核酶和脱氧核酶的体外进化 93
4.4.2体外选择别构核酶 97
4.4.3核酶的连续体外进化 101
4.4.4核蛋白酶的体外选择 102
4.4.5延伸蛋白质编码的核酶体外选择 104
4.4.6体外选择环状核酶 107
4.4.7核酶／脱氧核酶的催化潜能和进化策略 110
参考文献 113
5.1引言 118
第5章蛋白质酶定向分子进化 118
5.2.1基因复制 119
5.2自然界蛋白质进化机制 119
5.2.2串联复制 120
5.2.3环状变换 121
5.2.4寡聚合 122
5.2.5基因融合 122
5.2.6结构域募集 123
5.2.7外显子改组 124
5.3.1组合定向进化 125
5.3定向分子进化 125
5.3.2模块定向进化 130
5.3.3杂合酶 140
5.3.4定向共进化 145
5.3.5适应性进化 146
5.3.6稳定性和活性的进化 150
5.3.7底物特异性的进化 151
5.3.8对映体选择性的进化 155
5.3.9（β/α）8－桶酶的功能进化 170
5.4.1应用进化策略研究分支酸变位酶的结构和功能 172
5.4应用进化策略研究酶的结构和功能 172
5.4.2应用进化策略研究DNA聚合酶的结构和功能 178
参考文献 184
第6章外显子改组定向进化酶 186
6.1引言 186
6.2外显子改组的分子机制 187
6.3蛋白质结构域是运动的功能模块 189
6.4.1血液凝集和血纤维溶解的蛋白酶 192
6.4外显子改组产生模块酶 192
6.4.2模块交换的原理 196
6.4.3模块交换的机制 198
6.5体外外显子改组 199
6.5.1策略和方法 199
6.5.2组合结构域重组 201
6.5.3体外外显子改组实例 203
参考文献 204
7.1引言 206
第7章抗体酶定向分子进化 206
7.2抗体酶定向分子进化策略 207
7.2.1突变策略 207
7.2.2组合抗体库策略 208
7.2.3噬菌体抗体库 209
7.2.4合成抗体库策略 209
7.2.5结合荧光素scFv抗体库 210
7.2.6 T－细胞受体策略 210
7.3.1结合、催化和免疫组分策略 211
7.2.7提高催化活性策略 211
7.3抗体酶定向分子进化筛选／选择策略 211
7.3.2理论检验策略 212
7.4抗体酶定向分子进化筛选／选择方法 216
7.4.1直接筛选 216
7.4.2化学筛选 216
7.4.3遗传选择 217
7.4.4动力学选择 219
7.4.5应用反应化合物体外选择抗体酶 221
7.4.6催化抗－DNA抗体的筛选方法 222
7.4.7选择性感染噬菌体 223
参考文献 224
第8章蛋白质组、代谢途径、病毒和细胞的定向进化 225
8.1引言 225
8.2结构基因组定向进化的策略和方法 226
8.2.1融合报告 227
8.2.2宿主细胞应激反应报告 229
8.2.3直接检验 229
8.3基因组改组 230
8.3.1基因组改组改进泰乐菌素生产菌表型 231
8.3.2基因组改组改进乳酸生产菌表型 235
8.4生物合成途径定向进化 237
8.4.1 β－葡糖苷酸酶定向进化 237
8.4.2三嗪水解酶类定向进化 239
8.4.3类胡萝卜素生物合成途径定向进化 240
8.4.4 L－甲硫氨酸生物合成途径定向进化 243
8.5病毒定向进化 245
8.6微生物细胞定向进化 248
参考文献 250