1 概 论 1
1.1 基因疫苗发展概况 1
1.2 基因疫苗的特点 4
1.2.1 抗原性强 4
1.2.2 保护时间长 5
1.2.3 基因疫苗改造方便 5
1.2.4 制备和储运方便 6
2.1 天然免疫机制 7
2 基因疫苗工作原理 7
2.2 基因疫苗经肌肉组织免疫的抗原呈递 8
2.3 基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原呈递 10
2.3.1 直接免疫 11
2.3.2 用重组减毒胞内菌系统 12
2.3.2.1 胞内菌的胞内定位及其对基因疫苗的呈送 12
2.3.2.2 携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制 13
3 基因疫苗抗原基因的筛选与克隆 14
3.1 疾病有关基因疫苗的候选基因筛选 14
3.1.1.1 细菌病亚单位疫苗的编码基因作为基因疫苗候选基因 15
3.1.1.2 病毒病亚单位疫苗编码基因作为基因疫苗的候选基因 15
3.1.1 将亚单位疫苗的编码基因作为候选基因 15
3.1.1.3 寄生虫基因疫苗的候选基因 16
3.1.2 从病原体中筛选保护性抗原基因 17
3.1.2.1 表达文库筛选候选基因 17
3.1.2.2 免疫筛选法 18
3.1.2.3 化学分解法 18
3.1.3 定位克隆 18
3.1.3.1 家系连锁分析法 19
3.1.3.2 等位基因共享法 20
3.1.3.3 群体相关分析法 20
3.1.4 mRNA差异显示技术筛选候选基因 21
3.1.3.4 cDNA筛选 21
3.1.4.1 酶降解减数cDNA文库法 23
3.1.4.2 减数cDNA文库筛选法 23
3.1.4.3 PCR放大差异法 24
3.1.4.4 差异反转录PCR法和差异消减显示法 25
3.1.4.5 基因组错配扫描法 25
3.1.4.6 限制性标记cDNA扫描 26
3.1.4.7 消减杂交 26
3.1.4.8 mRNA差异显示技术改进 28
3.2.1.1 多肽N端序列指导PCR引物合成法 30
3.2.1 克隆已知多肽的基因 30
3.2 候选抗原基因克隆 30
3.2.1.2 特异性抗体筛选表达文库法 31
3.2.1.3 人工合成候选基因 31
3.2.2 克隆已知序列基因家族新成员 31
3.2.2.1 同源探针筛选法 31
3.2.2.2 PCR放大建库法 32
3.2.3 功能性筛选 32
3.2.4.1 质粒特性 33
3.2.4.2 质粒载体必须具备的条件 33
3.2.4 常用的克隆载体 33
3.2.4.3 常用的克隆质粒 35
4 基因疫苗的构建 37
4.1 构建基因疫苗的载体 37
4.1.1 真核表达载体的结构特点 37
4.1.1.1 增强子－启动子元件 37
4.1.1.2 载体的选择标记 38
4.1.1.3 哺乳动物细胞和大肠杆菌的复制起始点 39
4.1.1.4 转录终止信号和多聚腺苷酸化信号 39
4.1.3.2 pBudCE4 40
4.1.3.1 pcDNA3.1/Zeo(+/-) 40
4.1.3 常用于构建基因疫苗的载体 40
4.1.2 影响外源基因表达的因素 40
4.1.3.3 pRc/CMV2 41
4.1.3.4 pRc/RSV 41
4.2 基因疫苗构建方法 41
4.2.1 抗原基因和载体的制备 41
4.2.2 抗原基因和载体的连接 43
4.2.2.1 连接方式 43
4.2.2.2 连接反应条件 44
4.2.3.1 氯化钙共沉淀法 45
4.2.3 重组质粒转化受体菌 45
4.2.3.2 电穿孔法 46
4.2.4 重组质粒的筛选与鉴定 46
4.2.4.1 插入片段长度鉴定 47
4.2.4.2 插入片段方向性鉴定 47
4.2.4.3 DNA序列测定 47
4.3 重组质粒在真核细胞中表达与检测 49
4.3.1 重组质粒导入真核细胞的方法 49
4.3.1.1 脂质体介导的基因转移 49
4.3.1.3 电穿孔法 50
4.3.1.2 磷酸钙共沉淀法 50
4.3.2 抗原基因在真核细胞中表达的检测 51
4.3.2.1 蛋白水平的检测 51
4.3.2.2 核酸水平的检测 53
5 基因疫苗制备 55
5.1 基因疫苗小量制备 55
5.1.1 受体菌筛选 55
5.2.1 基因疫苗中量制备 56
5.2 基因疫苗中量制备 56
5.1.3 基因疫苗小量制备 56
5.1.2 培养条件优化 56
5.2.2 基因疫苗纯化 57
5.2.2.1 细菌的裂解和基因疫苗初步提取 57
5.2.2.2 质粒纯化 58
5.2.2.3 重组质粒浓缩 60
5.2.3 基因疫苗质量监控 61
5.2.3.1 重组质粒浓度测定 61
5.2.3.2 纯度测定 61
5.2.3.5 内毒素 63
5.2.3.4 限制性内切核酸酶图谱分析 63
5.2.3.3 分子质量鉴定 63
5.3 基因疫苗大量制备 64
5.3.1 中试规模 64
5.3.2 工程菌的发酵条件 64
5.3.2.1 发酵监测参数 65
5.3.2.2 发酵方式 65
5.3.2.3 基质浓度对发酵的影响 66
5.3.2.4 温度对发酵的影响 66
5.3.2.5 pH对发酵的影响 68
5.3.2.6 溶解氧浓度对发酵的影响 69
5.3.2.7 二氧化碳对发酵的影响 71
5.3.2.8 泡沫控制 71
5.3.3 基因疫苗大量纯化工艺 73
5.3.3.1 细胞破碎 73
5.3.3.2 重组质粒粗提 73
5.3.3.3 粗提物纯化 74
5.3.4 大量制备的质量控制 80
5.3.4.1 原料质量控制 81
5.3.4.3 纯化过程质量控制 82
5.3.4.4 成品质量控制 82
5.3.4.2 培养过程的质量控制 82
6 基因疫苗免疫方法 84
6.1 基因疫苗免疫方法 84
6.1.1 肌肉注射法 84
6.1.1.1 肌肉组织预处理 85
6.1.1.2 肌肉注射操作例子 85
6.1.1.3 影响重组质粒进入肌细胞的因素 86
6.1.2 基因枪导入法 86
6.1.2.1 皮下基因免疫的组织学基础 86
6.1.2.3 重组质粒包被方法 87
6.1.2.2 基因枪工作原理 87
6.1.3 黏膜表面涂布法 88
6.1.4 静脉注射法 88
6.1.5 腹腔注射法 88
6.1.6 不同免疫途径的免疫效果比较 89
6.2 免疫剂量和加强免疫 89
6.2.1 免疫剂量 89
6.2.2 加强免疫 90
7 基因疫苗免疫效果检测 91
7.1 体液免疫检测 91
7.1.1.2 竞争法测抗原或抗体 92
7.1.1 酶联免疫吸附试验 92
7.1.1.1 夹心ELISA 92
7.1.1.3 间接法测抗体 93
7.1.2 生物素－抗生物素蛋白系统 93
7.1.2.1 标记抗生物素蛋白－生物素检测法 93
7.1.2.2 桥联抗生物素蛋白－生物素检测法 94
7.1.2.3 抗生物素蛋白－生物素化酶复合物检测法 94
7.1.3 生物素－链霉抗生物素蛋白系统 94
7.1.5 斑点－ELISA 95
7.2 细胞免疫检测 95
7.1.4 酶联免疫荧光测量法 95
7.2.1 T细胞功能测定 96
7.2.1.1 T细胞增殖反应测定 96
7.2.1.2 细胞毒T细胞（CTL）功能测定 98
7.2.2 NK细胞活性测定 99
7.2.2.1 形态学方法 99
7.2.2.2 51Cr释放法 100
7.2.3 细胞免疫反应的间接测定方法 100
7.2.3.1 免疫方法测定细胞因子含量 101
7.2.3.2 生物学方法测定细胞因子含量 101
7.2.3.3 细胞因子mRNA定量测定 102
8.1 接种方法对免疫效果的影响 103
8 影响基因疫苗免疫效果的因素 103
8.1.1 肌肉内注射 104
8.1.1.1 肌细胞摄取基因疫苗的假说 104
8.1.1.2 肌细胞持续表达基因疫苗 105
8.1.1.3 影响肌肉注射基因疫苗效果的因素 106
8.1.2 皮内注射 107
8.1.3 基因枪法 108
8.2.1 载体中CpG元件的免疫刺激作用 109
8.1.4“无针”注射法 109
8.2 载体特征对基因疫苗免疫效果的影响 109
8.2.1.1 CpG元件的免疫刺激作用 110
8.2.1.2 ISS对基因疫苗的免疫刺激作用 113
8.2.2 启动子对抗原基因转录水平的影响 115
8.2.3 载体大小对基因免疫的影响 116
8.2.4 多抗原表达 116
8.3.1 细胞因子的佐剂效应 117
8.3.1.1 免疫佐剂效应的表现 117
8.3 免疫佐剂和辅佐分子的作用 117
8.3.1.2 细胞因子的作用机制 119
8.3.2 趋化因子的佐剂效应 121
8.3.3 共刺激分子的佐剂效应 122
8.3.4 脂质体介导的基因免疫 124
8.3.5 微生物蛋白的佐剂效应 125
8.4 多种类型疫苗联合应用 125
8.5 机体对基因疫苗的影响 126
9.1 局部反应和全身毒性评定 127
9 基因疫苗的安全性 127
9.1.1 诱导机体产生特异性免疫耐受 128
9.1.2 自身免疫反应 128
9.2 遗传毒性评定 128
9.3 生殖毒性评定 129
9.4 肿瘤发生评定 129
9.4.1 整合到基因组中的可能性 129
9.4.2 抗原基因选择 130
9.5 基因免疫效果评定 130
9.6 佐剂和免疫苗设备评定 130
10.1.1 传统疫苗 131
10.1.2 基因疫苗 131
10.1 布氏杆菌基因疫苗 131
10 细菌病基因疫苗 131
10.2 结核杆菌基因疫苗 132
10.2.1 传统疫苗 132
10.2.2 基因疫苗 133
10.3 肺炎球菌基因疫苗 134
10.3.1 传统疫苗 134
10.3.2 基因疫苗 135
10.4 肺炎枝原体基因疫苗 135
10.4.2 基因疫苗 136
10.4.1 传统疫苗 136
10.5 沙眼衣原体基因疫苗 137
10.5.1 传统疫苗 137
10.5.2 基因疫苗 137
10.6 破伤风杆菌基因疫苗 138
10.6.1 传统疫苗 138
10.6.2 基因疫苗 138
10.7 蜱媒螺旋体病基因疫苗 139
10.7.1 传统疫苗 139
10.7.2 基因疫苗 140
11.1.2 HBV基因疫苗 141
11.1.1 HBV传统疫苗 141
11 病毒病基因疫苗 141
11.1 乙型肝炎基因疫苗 141
11.1.2.1 抗原基因 142
11.1.2.2 基因疫苗现状 142
11.2 丙型肝炎病毒基因疫苗 144
11.2.1 HCV核心区基因疫苗的构建 144
11.2.2 HCV包膜区基因疫苗的构建 145
11.2.3 C+E区基因疫苗的构建 145
11.2.4 HCV非结构区（NS区）基因疫苗的构建 146
11.3 艾滋病基因疫苗 146
11.3.1.1 减毒活疫苗和灭活疫苗 147
11.3.1 传统的艾滋病疫苗 147
11.3.1.2 亚单位蛋白疫苗 148
11.3.2 基因疫苗 148
11.4 流感病毒基因疫苗 151
11.4.1 H1和H7基因疫苗 152
11.4.2 HA基因疫苗 153
11.4.3 NP基因疫苗 153
11.5 狂犬病基因疫苗 154
11.6.1.1 灭活疫苗 155
11.6.1 常规疫苗 155
11.6 登革病毒基因疫苗 155
11.6.1.2 活疫苗 156
11.6.1.3 亚单位疫苗 157
11.6.2 基因疫苗 158
11.7 其他病毒基因疫苗 158
11.7.1 汉坦病毒基因疫苗 158
11.7.2 牛传染性鼻气管炎病毒 159
11.7.3 单纯疱疹基因疫苗 159
12 寄生虫病基因疫苗 160
12.1.1 传统疫苗 161
12.1 疟疾基因疫苗 161
12.1.2 基因疫苗 162
12.1.2.1 孢子体表面蛋白2基因疫苗 162
12.1.2.2 环子孢子蛋白基因疫苗 162
12.1.2.3 疟原虫蛋白17基因疫苗 164
12.1.2.4 HEP17/CSP联合基因疫苗 165
12.1.2.5 裂殖子主要表面蛋白基因疫苗 165
12.1.2.6 有性期抗原基因疫苗 165
12.2.1.3 抗独特型抗体疫苗 166
12.2.1.2 研制混合多价疫苗 166
12.2.1 传统疫苗 166
12.2.1.1 构建基因工程菌株和人工载体疫苗 166
12.2 日本血吸虫基因疫苗 166
12.2.1.4 血吸虫病合成多肽疫苗 167
12.2.1.5 抗卵免疫研究 167
12.2.2 基因疫苗 167
12.2.2.1 虫卵蛋白基因疫苗 167
12.2.2.2 虫体蛋白基因疫苗 168
12.3 利什曼病基因疫苗 169
12.3.1 传统疫苗 170
12.3.2 基因疫苗 171
12.4 猪带绦虫病基因疫苗 171
12.4.1 传统疫苗 171
12.4.2 基因疫苗 172
13 肿瘤基因疫苗 173
13.1 肿瘤抗原及相关抗原 173
13.2 传统肿瘤疫苗 175
13.2.1 过继免疫治疗 175
13.2.2 肿瘤细胞疫苗 175
13.2.3.1 导入细胞因子基因 176
13.2.3 基因修饰的瘤苗 176
13.2.3.2 导入癌基因或肿瘤相关抗原基因 177
13.2.3.3 导入共刺激分子 177
13.2.3.4 导入MHC基因 178
13.2.4 蛋白／肽疫苗 178
13.2.4.1 蛋白疫苗 178
13.2.4.2 肽疫苗 181
13.2.5 荷载肿瘤细胞抗原肽的树突细胞肿瘤疫苗 181
13.3 肿瘤基因疫苗 182
13.3.1 病毒抗原基因疫苗 183
13.3.2 发育肿瘤抗原基因疫苗 184
13.3.2.1 癌胚抗原基因疫苗 184
13.3.2.2 人绒毛膜促性腺素β亚单位基因疫苗 184
13.3.3 理化因素相关肿瘤的基因疫苗 185
13.3.4 癌／原癌基因疫苗 186
13.3.5 特异抗体可变区基因疫苗 187
13.3.6 细胞因子基因疫苗 187
13.3.7 MHC基因疫苗 187
13.3.8 MUCl等黏附蛋白基因疫苗 188
13.3.9 RNA疫苗 188
13.3.10 肿瘤基因疫苗靶向治疗 189
13.3.10.1 肿瘤内免疫基因疫苗 191
13.3.10.2 靶基因组织特异表达 191
13.3.10.3 受体介导 191
14 控制动物生产性能的基因疫苗 192
14.1 蛋白质抗原性分析方法 192
14.1.1 蛋白质分析软件 192
14.1.2 ANTHEPROT应用方法 193
14.1.2.1 工具栏与基本功能 193
14.1.2.2 蛋白质序列编辑功能 194
14.1.2.3 蛋白质基本分析功能 195
14.1.2.4 结果的输出以及与其他应用程序进行数据交换 203
14.2 抑制素基因疫苗 206
14.2.1 抑制素常规疫苗 206
14.2.1.1 抑制素来源 206
14.2.1.2 抑制素主动免疫提高家畜排卵率 207
14.2.1.3 抑制素被动免疫提高家畜排卵率 208
14.2.2 抑制素基因疫苗 209
14.2.2.1 抑制素真核表达质粒的构建 209
14.2.2.2 抑制素基因免疫 209
主要参考文献 212