第1章 绪论 1
背景 1
目录 1
前言 1
环境的控制 4
组织培养的优点 4
专业技能 5
局限性 5
样品的特征和均一性 5
经济、规模和机械化 5
体内模型 5
不稳定性 6
细胞的起源 6
量的问题 6
去分化和选择 6
组织培养的类型 7
体外的主要差异 7
细胞黏附 10
培养细胞的环境 10
第2章 培养细胞的生物学 10
细胞黏附分子 11
细胞周期 12
细胞增殖 12
细胞骨架 12
细胞增殖的控制 13
细胞去分化 14
细胞分化的维持 14
细胞分化 14
能量代谢 17
细胞系的演化 18
培养的开始 18
细胞的衰老 19
连续细胞系的形成 20
培养细胞的起源 21
规划 23
第3章 设计与布局 23
建设与使用 26
无菌操作区 27
布局 27
温室 28
培养箱 28
洗涮 32
准备 32
操作台 32
储存 33
组织培养实验室的要求 36
第4章 设备 36
洁净台 37
必需设备 37
培养箱 38
除菌器 39
CO2培养箱 39
冰箱和冷冻箱 41
清洗 42
倒置显微镜 42
水的纯化 43
除菌和干燥 43
冷藏器 44
离心机 44
细胞计数器 45
辅助设备 45
天平 45
血细胞计数板 45
抽气泵 46
温度记录仪 47
解剖镜 47
pH计 47
电导仪 47
渗透压计 47
普通显微镜 47
液体操作 48
滚动架 48
磁力搅拌器 48
玻璃器皿清洗机 53
低温冷冻箱 53
其他常用设备 53
视频摄像机和显示器 54
消耗性物品 55
流式细胞仪 55
集落计数器 55
可控速率冷冻箱 55
离心淘洗机 55
无菌容器 56
培养器皿 56
吸管 56
除菌过滤 57
注射器和针头 57
无菌的维持 58
无菌技术的目标 58
第5章 无菌技术 58
工作面 59
安静的工作区域 59
创造无菌环境的各种因素 59
培养物 61
试剂和培养基 61
个人卫生 61
灼烧 62
加盖 62
灭菌操作 62
擦拭 62
移液 63
试剂瓶和培养瓶的操作 63
层流 64
倒出液体 64
方案5.1 在洁净台内进行无菌操作 66
标准方法 66
方案5.2 在敞开的工作台上进行操作 68
方案5.3 培养皿和培养板的操作 70
培养平皿和多孔培养板 70
培养箱 71
仪器和设备 71
训练 72
充入CO2气体 72
盒装培养物 72
危险性评估 74
第6章 安全性 74
安全规则 76
标准操作程序 76
设备 77
操作者 77
常规安全 77
玻璃器皿和锐利的物品 78
气体 79
化学毒性 79
火 80
液氮 80
生物危害性 81
高能源 81
放射性 81
摄入 81
标记的试剂 81
防范水平 82
人的活检材料 84
丢弃物处理 85
遗传操作 85
附着材料 86
细胞的附着和生长 86
第7章 培养器皿 86
附着物 86
细胞产量 87
培养器皿的选择 87
悬浮培养 89
制样和分析 90
通风 90
价格 91
不均匀生长 91
透性支持物 92
特殊系统 92
基质覆盖 93
表面处理 93
方案7.1 细胞外基质（ECM）的制备 94
三维基质 95
饲养层 95
非黏附性附着面 96
各种人工附着面 96
液-胶或液-液界面 97
pH 98
物理化学特征 98
第8章 培养基 98
培养基的发展史 98
CO2和碳酸盐 99
方案8.1 pH标准色阶的制备 99
氧气 101
缓冲作用 101
温度 102
渗透压 102
表面张力和成泡性 103
黏滞度 103
完全培养基 104
平衡盐溶液 104
氨基酸 105
有机补充物 106
葡萄糖 106
维生素 106
盐类 106
血清 112
抗生素 112
激素和生长因子 112
生长因子 113
蛋白质 113
矿物质 115
脂类 115
激素 115
营养物及代谢物 115
培养基和血清的选择 116
抑制物 116
血清的测试 118
批次预约 118
胚胎浸出液 119
其他添加物 119
热灭活 119
适应性培养基 120
使用含血清的培养液的缺点 121
第9章 无血清培养液 121
无血清培养液的优点 122
血清的替代 123
无血清培养液的缺点 123
具有选择性 123
调节细胞增殖、分化 123
生长因子 124
激素 124
传代培养 124
无血清培养液的选择 138
基质 138
血清中的营养物质 138
蛋白质和多聚胺 138
血清替代物 139
无血清培养液的商业供应 139
小结 142
无血清培养基的制备 142
无血清培养液的研发 142
玻璃器皿 144
设备 144
第10章 准备与灭菌 144
方案10.1 玻璃器皿的准备和灭菌 147
方案10.2 移液管的准备和灭菌 150
移液管 150
螺口盖 151
方案10.3 螺口盖的准备和灭菌 153
种类繁杂的设备 154
清洁剂的选择 154
方案10.4 过滤装置的灭菌 155
可重复使用的灭菌过滤器 155
试剂和培养基 156
水 157
平衡盐溶液 158
培养基 159
方案10.5 BSS的制备 159
方案10.6 用1×储存液制备培养基 160
方案10.7 用10×浓缩液配制培养基 161
方案10.8 以干粉配制培养基 164
干粉培养基 164
特制培养基 165
方案10.9 特制培养基的准备 166
除菌过滤 168
灭菌 168
方案10.11 使用过滤瓶的灭菌过滤 171
方案10.10 用注射器式过滤器进行灭菌过滤 171
方案10.12 使用小型直线式过滤器的灭菌过滤 172
血清 173
方案10.13 使用大型直线式过滤器进行灭菌过滤 173
方案10.14 血清的收集与灭菌 174
方案10.15 血清的透析 176
无菌检测 177
质量控制 177
其他试剂的准备与灭菌 177
培养基的质控、检测和储存 177
培养检测 178
保存 179
组织分离 180
原代培养的类型 180
第11章 原代培养 180
方案11.1 分离小鼠胚胎 182
小鼠胚胎细胞培养 182
方案11.2 分离鸡胚 183
鸡胚细胞培养 183
人体活检材料 186
原代外植 188
原代培养 188
方案11.3 人体活检组织 188
方案11.4 原代外植 189
酶的解离作用 191
方案11.5 胰酶的温消化 192
方案11.6 胰酶的冷消化 195
低温预处理的胰酶消化 195
方案11.7 鸡胚器官原基 196
鸡胚器官原基 196
其他酶解过程 200
方案11.8 用胶原酶消化 201
胶原酶 201
方案11.9 利用筛网的机械分离法 203
机械消化 203
方案11.10 富集存活细胞 205
分离活细胞 205
原始记录 207
原代培养小结 207
传代培养和扩增 208
命名 208
第12章 细胞系 208
细胞系的命名 212
细胞系的永生化 212
细胞系的选择 213
细胞形态学 214
常规培养 214
方案12.1 更换培养基 215
体积、深度和表面积 215
培养基的更换 215
传代 216
维持培养基 216
传代标准 217
方案12.2 传代 218
传代比率和生长周期 220
悬浮培养细胞的增殖 222
传代时的细胞浓度 222
方案12.3 悬浮细胞传代 224
悬浮培养物的传代 224
培养记录 225
抗生素的使用 225
克隆培养 228
第13章 克隆培养及筛选 228
方案13.1 稀释法克隆培养 229
贴瓶率的激活 231
促进克隆生长的方法 232
饲养层细胞 233
方案13.2 条件培养基的制备 233
条件培养基 233
方案13.3 饲养层的准备 234
方案13.4 琼脂中克隆培养 235
悬浮克隆培养 235
方案13.5 美希索中克隆培养 238
方案13.6 用克隆环分离细胞克隆 240
克隆的分离 240
方案13.7 辐射法分离细胞集落 242
方案13.8 悬浮细胞克隆的分离 243
悬浮细胞克隆 243
单层贴壁细胞克隆的其他分离技术 243
选择性抑制剂 244
复制性培养 244
方案13.9甲氨蝶呤抗性和DHFR扩增 246
遗传变异细胞的筛选 246
选择性黏附 247
细胞与基质的相互作用 247
基质的性质 248
选择性解离 248
半固体培养基 251
选择性饲养层 251
方案14.1 密度梯度细胞分离法 253
细胞密度及等密度沉降法 253
第14章 细胞分离 253
免疫盘化法 257
免疫磁珠分离法 257
基于抗体的分离技术 257
方案14.2 磁性激活的细胞分选法（MACS） 260
离心淘洗分离技术 261
细胞体积与沉降速度 261
荧光激活的细胞分选法 262
其他分离技术 265
初试细胞分离者的选择 266
鉴定的需要 268
第15章 细胞鉴定 268
谱系或组织标记 269
种属鉴定 269
独特的标记 270
形态学 271
转化 271
方案15.1 倒置显微镜的使用 273
显微镜使用 273
方案15.2 GIEMSA染色 274
染色 274
方案15.3 结晶紫染色 275
细胞学检查所用培养器皿 276
方案15.4 涂片制备 277
悬浮细胞细胞学检查标本的制备 277
方案15.5 细胞离心机 278
方案15.6 过滤细胞学 279
方案15.7 利用胶片进行显微照相 280
照相技术 280
方案15.8 显微镜电子成像 282
电子影像记录 282
方案15.9 染色体制备 283
染色体分析 283
染色体显带技术 285
变异 286
染色体分析 286
DNA指纹技术 288
DNA杂交 288
染色体染色 288
DNA含量 288
方案15.10 细胞系的多位点DNA指纹检测 289
原理 289
同工酶 295
酶活性 295
RNA和蛋白质 295
方案15.11 同工酶分析 296
原理 296
抗原标记 299
多样性 299
分析 299
方案15.12 间接免疫荧光 301
证明 302
分化 302
其他方法 302
去分化 304
表现型的体内表达 304
第16章 分化 304
增殖和分化 305
定向和分化的各个阶段 305
定向和细胞谱系 306
分化标记物 307
可溶性诱导剂 308
诱导分化 308
旁分泌生长因子 311
细胞的相互作用 311
细胞-基质相互作用 312
负向作用的旁分泌因子 312
极性和细胞形状 313
应用方面 314
分化和恶性 314
细胞系特性的作用 316
第17章 转化 316
什么是转化？ 317
遗传不稳定性 318
永生性 319
DNA含量 319
染色体畸变 319
病毒基因的永生性 320
衰老的控制 320
方案17.1 成纤维细胞的永生性 321
人类成纤维细胞的永生性 321
转染后的培养物培养 324
停泊非依赖性 325
生长控制的异常 325
端粒酶诱导的永生性 325
转基因小鼠 325
接触抑制 326
方案17.2 细胞增殖的密度限制 328
血清依赖性 329
恶性肿瘤 330
肿瘤发生 330
侵袭性 331
致瘤作用 331
血管形成 332
纤溶酶原激活剂 333
污染源 334
第18章 污染 334
操作人员的技术 336
潮湿培养箱 337
使用和维护洁净台的层流 337
环境 337
无菌材料 338
冷冻储藏 338
方案18.1 清洁培养箱 338
污染的检测 339
微生物污染的种类 339
引入的细胞系和活检 339
检疫 339
支原体 340
可见的微生物污染 340
原则 342
方案18.2 荧光检测支原体 343
方案18.3 消灭微生物的污染 345
细菌、真菌和酵母 345
病毒污染 345
污染的去除 345
持久的污染 346
病毒污染的消除 346
支原体的消除 346
交叉污染 347
结论 348
细胞系的选择 349
保存 349
第19章 冷冻保存 349
冷冻保存的必要性 349
冷冻的理由 349
冷冻保存的阶段 350
培养条件的标准化 350
方案19.1 冷冻细胞 353
冷冻冰箱 357
冷冻率 357
方案19.2 融化冷冻细胞 359
冷冻柜记录 359
运送细胞 361
细胞库 361
连续置换 361
活的培养 362
冷冻安瓿 362
方案20.1 用血细胞计数板进行细胞计数 363
血细胞计数板 363
第20章 定量 363
细胞计数 363
电子计数 366
方案20.2 电子细胞计数 367
细胞重量 369
单层培养的染色 369
细胞大小测定 369
蛋白质 370
方案20.3 用Hoechst 33258测定DNA 370
DNA含量 370
方案20.4 用Bradford方法测定蛋白质含量 371
样品的溶解性 371
方案20.5 DNA合成 372
DNA合成 372
合成率 372
方案20.6 蛋白质合成 373
蛋白质合成 373
酶检测和免疫检测标本的制备 374
重复取样问题 375
流式细胞术 375
细胞计数术 375
原位标记 375
细胞增殖 376
数据分析 376
数据的获得 376
生长周期 377
实验设计 377
方案20.7 生长曲线，单层 378
生长周期分析 380
方案20.8 生长曲线，悬浮培养 380
悬浮培养 380
生长周期的变化 382
方案20.9 贴壁效率 383
贴壁效率 383
自动集落计数 384
方案20.10 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数 385
标记指数 385
方案20.11 生长分数的测定 387
生长分数 387
细胞迁移 388
细胞周期时间 388
有丝分裂指数 388
分裂指数 388
导言 389
第21章 细胞毒性 389
分析的性质 390
体外局限性 390
方案21.1 染料排斥法测定细胞生存力 391
生存力 391
存活 392
方案21.2染料摄取法测定细胞生存力 392
方案21.3 克隆形成试验 393
代谢测定 397
细胞增殖测定 397
方案21.4 基于MTT的细胞素性试验 398
微滴定试验 398
其他说明 401
药物的相互作用 403
微滴定与克隆的比较 403
背景 404
转化 404
抗癌药物筛选 404
前瞻性试验 404
方案21.5 姐妹染色单体交换 405
致癌性 408
其他说明 408
炎症反应 409
上皮细胞 410
第22章 特殊细胞的培养 410
表皮 411
方案22.1表皮角质形成细胞 412
其他方法 415
细胞特征 415
方案22.2 角膜上皮细胞 416
角膜 416
乳腺 418
方案22.3 乳腺上皮 419
方案22.4 子宫颈部上皮 420
子宫颈 420
方案22.5 结肠直肠上皮 424
胃肠道 424
方案22.6 大鼠肝细胞的分离 427
肝 427
方案22.7 胰腺上皮 429
胰 429
肾 431
方案22.8 肾上皮 432
气管和支气管上皮 433
方案22.9 气管和支气管上皮 434
前列腺 435
方案22.10 前列腺上皮 436
脂肪组织 438
结缔组织 438
间充质细胞 438
方案22.11 脂肪细胞的原代培养 439
肌 440
方案22.12 骨骼肌 441
增殖和分化指数 442
方案22.13 用藻酸盐微珠培养软骨细胞 443
软骨 443
其他说明和应用 443
方案22.14 成骨细胞 447
骨 447
内皮细胞 449
方案22.15 血管内皮细胞的培养 450
神经细胞 451
神经外胚层细胞 451
方案22.16 小脑颗粒细胞的培养 452
神经胶质细胞 453
方案22.17 嗅球成鞘细胞 455
方案22.18 黑素细胞的培养方法 458
黑素细胞 458
内分泌细胞 458
造血细胞 461
方案22.19 骨髓造血细胞的长期培养方法 462
骨髓的长期培养 462
方案22.20 造血细胞克隆形成的实验方法 464
造血细胞集落形成实验 464
胚层细胞 467
生殖腺 467
第23章 肿瘤细胞培养 468
取材 469
原代培养 470
分离 470
细胞系的建立 471
肿瘤细胞的特征 471
选择性培养基 472
选择培养 472
连续细胞系 472
方案23.1 在汇合的饲养层上培养 473
汇合的饲养层 473
组织型培养 475
悬浮克隆 475
方案23.2 冻存活检标本 476
冷冻组织保存 476
异种移植 476
结肠 477
肺 477
特殊肿瘤类型 477
乳腺 477
皮肤 478
前列腺 478
胰腺 478
卵巢 478
精原细胞瘤 479
神经母细胞瘤 479
子宫颈 479
模型的选择 480
相互作用 480
第24章 器官型培养 480
细胞的相互作用和表型表达 480
气体和营养物质的交换 481
器官培养 481
器官培养的局限性 482
生长与分化 482
结构的完整性 482
方案24.1 器官培养 483
器官培养的类型 483
中空纤维 485
凝胶和海绵技术 485
组织型培养 485
方案24.2 球体培养 486
球体 486
藻酸盐活细胞固定术 488
方案24.3 藻酸盐包围 489
滤孔嵌套 490
方案24.4 滤孔嵌套 491
方案24.5 神经聚集物 493
神经聚集物培养 493
悬浮规模培养 496
第25章 规模培养 496
方案25.1 搅拌4L分批式悬浮培养 497
连续培养 499
搅匀和换气 500
规模和复杂性 500
方案25.2 Nunc细胞工厂 503
多表面增殖 503
单层规模培养 503
旋转培养 505
多列阵培养皿、螺旋柱和培养管 505
方案25.3 旋转瓶培养 506
微载体 508
方案25.4 微载体 509
灌流式单层培养 510
细胞生长的监控 511
第26章 特殊技术 514
淋巴细胞的分离 514
方案26.1 淋巴细胞的分离 514
原始细胞的转化 515
方案26.2 用PHA刺激淋巴细胞 515
放射自显影术 516
方案26.3 显微放射自显影术 517
间隔性记录 522
方案26.4 间隔性摄像 523
共聚焦显微镜 525
细胞同步化 525
细胞分离 525
阻断 525
羊膜细胞培养 526
方案26.5 羊膜细胞的培养 526
冷血动物细胞的培养 533
鱼细胞 533
方案26.6～26.8 所用试剂和培养基 534
方案26.6 从斑马鱼胚获得成纤维细胞饲养层 535
方案26.7 斑马鱼胚细胞的原代培养 536
方案26.8 建立斑马鱼胚细胞系 537
方案26.9 昆虫细胞的扩增 538
采用原位杂交技术对RNA基因表达的分析 540
原位分子杂交 540
方案27.1 原位杂交中的放射自显影技术 540
细胞培养的分子生物学 540
第27章 分子技术 540
荧光原位杂交技术在基因及染色体分析中的应用 546
方案27.2 利用单拷贝基因组探针及染色体刷漆进行荧光原位杂交 546
体细胞融合 549
方案27.3 细胞杂交 551
杂交克隆的筛选 552
单染色体移植 553
单克隆抗体的制备 553
移核实验 553
方案27.4 单克隆抗体的制备 554
转基因 559
磷酸钙共沉淀 560
方案27.5 磷酸钙介导DNA稳定转染 560
脂质体介导的转染 562
方案27.6 脂质体介导的瞬时转染 562
电穿孔法 564
方案27.7 电穿孔法稳定转染 564
其他DNA转移方法 566
报告基因 567
方案27.8 β-半乳糖苷酶的原位染色 567
方案27.9 氯霉素乙酰基转移酶（CAT）测定 568
第28章 问题与对策 570
细胞生长缓慢 570
实验室是否发生其他变化？ 571
是否培养基出现问题？ 572
某些不稳定的试剂 573
选择正确的培养基至关重要 573
谷氨酰胺 573
培养基的选择 573
纯水器工作是否正常？ 574
配制培养基各种成分的纯度 574
化学污染或玻璃蒸馏水器上是否有残留物？ 574
塑料管中是否有化学残留物？ 574
胰蛋白酶 574
其他成分 574
血清 574
塑料制品 575
血清 575
玻璃器皿 575
微生物污染 575
抗菌素 575
碳酸氢钠 575
针对单一使用者 576
针对多人共有的问题 577
污染物的鉴定 578
来自玻璃器皿的污染 579
吸液管 579
化学污染 579
原代培养 580
粉末或气溶胶 580
原代培养常见的问题 580
其他试剂 580
水的纯度 580
细胞选择有误 581
污染 581
如果克隆太弥散 582
如果出现细胞贴壁效率降低 582
如果每个培养皿中克隆数目过多 582
克隆 582
如果丧失产物形成能力 583
如果细胞不发生分化 583
饲养层 583
常规单层培养 583
分化 583
如果细胞呈现不贴壁现象 583
如果培养细胞出现非随机分布 583
培养基 584
老化 584
生长不均匀 584
交叉污染 584
传代培养的细胞周期 584
传代 584
克隆培养 584
冻存 585
“治疗” 585
如果复苏时活率不高 585
“预防” 585
“体征” 585
细胞成颗粒性 586
存货用磬 586
细胞内出现颗粒 586
污染 586
冻存后细胞形态发生变化 586
使用血球计数板 587
细胞计数 587
电子计数仪 587
细胞外出现颗粒 587
成活率检测 588
形态学观察 588
细胞毒性检测 588
成活率 588
结语 589
附录：试剂及配制 590
商业索引 600
材料来源 600
供应商和其他资源 605
参考文献 633
推荐参考书目 671
相关杂志 672
索引 673
词汇表 697
图版Ⅰ～Ⅻ 704