目 录 1
1概论 1
1.1 分子生物学诊断技术的崛起 1
1.2 常用的分子生物学诊断技术 2
1.2.1 用于分子生物学诊断的主要靶基因序列 2
1.2.2 常用的分子生物学诊断技术 2
1.3 分子生物学诊断技术与微生物分子生态学 9
1.4 分子生物学诊断技术在环境中的应用 11
1.4.1 诊断污染环境中微生物的群落结构和种群丰度 11
1.4.2 诊断污染环境中微生物的群落动态 12
1.4.3 诊断污染环境中微生物质粒的分子生态效应 12
1.4.4 监测和预警环境污染状况 13
1.5 分子生物学诊断技术展望 14
1.4.5 与降解有关基因的分子多态性 14
2 免疫技术对环境中污染物的检测 16
2.1 免疫分析的原理及类型 16
2.1.1 免疫分析的原理 16
2.1.2 免疫分析的分类 17
2.2 应用免疫分析技术检测环境中的残留农药 19
2.2.1 采用ELISA检测残留农药的改进方法 19
2.2.2 ELISA检测残留农药的一般程序 20
2.3 采用分子诊断技术对环境中毒素的检测分析 26
2.3.1 采用免疫分析对真菌毒素的分子诊断 26
2.3.2 采用免疫分析技术对细菌毒素的分子诊断 31
2.3.3 采用免疫分析技术对其他生物毒素的检测 32
2.4 免疫技术对环境中其他重要污染物的检测 33
3生物传感器对环境污染物的检测 36
3.1.1 基础电极设计的一般原则 37
3.1 生物传感器的基本原理 37
3.1.2 生物传感器应具备的特性 38
3.2 生物传感器的研究现状 39
3.2.1 酶传感器 39
3.2.2微生物传感器 41
3.2.3免疫传感器 43
3.2.4 组织传感器 45
3.2.5 其他新型免疫传感器 47
3.3 采用生物传感器对环境中的污染物进行监测 50
3.3.1 采用生物传感器对环境参数的监测 50
3.3.2 生物传感器对毒素物质的检测 53
3.3.3 利用生物传感器对残留农药的检测 53
3.3.4 采用传感器对重要污染物的检测 57
3.3.5 生物传感器对有机大分子的检测 62
3.3.6 生物传感器对环境中金属离子的检测 64
4基于分子诊断技术的环境致病微生物检测 66
4.1 利用PCR技术检测环境中的致病微生物 66
4.1.1 聚合酶链式反应 66
4.1.2 采用PCR技术检测病原菌 73
4.1.3 采用PCR检测环境中的病毒 78
4.1.4 PCR检测环境中的寄生虫 81
4.2 利用寡核苷杂交技术检测致病微生物 84
4.2.1 核酸探针杂交技术 84
4.2.2 采用DNA探针检测病原微生物 99
4.3 利用免疫分析技术检测致病微生物 107
4.3.1 免疫分析法检测病原细菌 107
4.3.2 ELISA法检测病原真菌 108
4.3.3 ELISA法检测病毒 109
4.4.1 检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定 111
4.3.4 ELISA法检测病原虫 111
4.4检测环境中病原微生物的其他快速方法 111
4.4.2 快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套鉴定系统 112
4.4.3 应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物 112
4.4.4 快速检出细菌的毒素 112
4.4.5 快速的细菌对抗菌药物的敏感性试验 113
4.4.6 化学传感器对病毒的快速监测 113
5 采用生物芯片检测环境微生物 115
5.1 生物芯片的工作原理 115
5.1.1 基因芯片 115
5.1.2 蛋白质芯片 120
5.1.3 芯片实验室 120
5.2.1制备靶分子 121
5.2.2 靶分子和分子探针进行杂交 121
5.2 基因芯片检测分析环境样品的步骤 121
5.2.3 结果检测和数据分析 122
5.3 DNA芯片在环境病原微生物检测中的应用 123
5.3.1 检测病原体的耐药性 124
5.3.2 快速诊断环境致病微生物 126
5.4 基因芯片技术的研究方向及当前面临的困难 130
6环境微生物的分子分类 132
6.1 微生物的分类系统 132
6.1.1 微生物的分类命名与鉴定 132
6.1.2 分类方法 136
6.2 DNA组成（G+C）分析 137
6.2.1 DNA中G十C含量的摩尔分数 137
6.2.2 G+C含量在细菌分类鉴定中的作用 139
6.2.3 测定基因组DNA的G+C含量 140
6.3.1 DNA的变性和复性 145
6.3 DNA-DNA分子杂交技术 145
6.3.2 DNA-DNA分子杂交技术 149
6.4 16S rRNA序列分析技术 152
6.4.1 16S rRNA的分子结构 152
6.4.2 16S rRNA序列分析技术 156
6.4.3 16S rDNA测序与细菌分类地位的确定 158
6.4.4 基于16S rDNA的系统发生分类法 160
6.5 rDNA转录间隔区序列分析技术 161
6.5.1 23S rRNA的分子结构 161
6.5.2 16S-23S rDNA间隔区 163
6.5.3 16 S-23S rDNA ISR在细菌分类和鉴定中的应用 165
6.5.4 真菌rDNA基因间隔区段序列分析及其应用 166
6.6 分子系统发育进化树的构建 168
6.6.1 分子进化的基本概念 168
6.6.2 分子进化模型与序列分歧度计算 169
6.6.3 分子系统树的构建 172
7分子标记技术与环境微生物多样性分析 177
7.1 限制性片段长度多态性分析及其在环境微生物检测中的应用 177
7.1.1 RFLP分析的基本原理 177
7.1.2 DNA片段的变异 178
7.1.3 RFLP的操作步骤与应用范围 180
7.2 随机扩增多态性DNA技术及应用 181
7.2.1 RAPD技术的基本原理 181
7.2.2 RAPD技术的操作程序 182
7.2.3 RAPD在微生物分类鉴定中的应用 183
7.3 DNA单链构象多态（SSCP）技术 184
7.3.1 PCR-SSCP技术的基本原理 184
7.3.2 操作程序 185
7.3.3 PCR-SSCP的优缺点分析 186
7.3.4 SSCP技术在检测突变方面的应用 187
7.4 扩增的限制性片段长度多态性（AFLP）技术 187
7.4.1 AFLP的基本原理 187
7.4.2 操作程序 188
7.4.3 AFLP技术的应用 190
7.5 扩增性限制性酶切片段分析及其应用 191
7.5.1 ARDRA的基本原理 191
7.5.2 ARDRA的操作程序 191
7.5.3 ARDRA技术的应用 192
7.6 AP-PCR的指纹图谱 195
7.6.1 AP-PCR的基本原理 195
7.6.2 AP-PCR指纹图谱在微生物菌体鉴别中的应用 195
7.6.4 tRNA基因重复序列之间的PCR 196
7.6.3 RNA的AP-PCR的指纹图谱 196
7.7 其他环境微生物多样性分析的分子标记技术 197
7.7.1 特异引物的PCR标记 197
7.7.2 ISSR标记 199
7.7.3 T RFLP 199
7.7.4 PCR-DGGE方法 200
7.7.5 温度梯度胶电技术 202
8环境微生物基因组和蛋白质组分析 203
8.1 环境微生物基因组分析 203
8.1.1 微生物基因组计划进展 203
8.1.2微生物基因组测序的策略 203
8.1.3微生物基因组的注释 205
8.2 嗜盐古细菌sp.NRC-1基因组概述 206
8.3 嗜热自养甲烷杆菌δ H菌株基因组概述 207
8.4詹氏甲烷球菌 208
8.5 闪烁古生球菌 210
8.6 环境群体微生物基因组的比较分析 212
8.6.1 天然微生物聚集体中的基因组 212
8.6.2 自然菌群基因组大片段文库 213
8.6.3 多变性——微生物群体基因组 214
8.7 环境微生物蛋白质的大规模分离技术 214
8.7.1 蛋白质双向电泳技术 215
8.7.2色谱－质谱技术 230
8.7.3 一维电泳（色谱）－质谱技术 232
8.8 环境微生物的高通量蛋白质鉴定技术 232
8.8.1 生物质谱技术 233
8.8.2 2-DE胶上蛋白质识别与鉴定技术 233
8.8.3 生物质谱新技术 234
8.9.1 环境胁迫条件下的微生物蛋白质组学 235
8.9 环境微生物蛋白质组学 235
8.9.2 病原微生物蛋白质组学 236
8.9.3 与微生物生理生化相关的定量蛋白质组学 236
8.9.4 亚蛋白质组学在环境微生物研究的应用 237
8.9.5 基因工程微生物蛋白质组学 237
8.10 微生物群落蛋白质组学 238
8.10.1 微生物群落蛋白质组学 238
8.10.2 自然微生物群落的蛋白质提取 239
9 利用分子诊断技术监测微生物群落结构和群落动态 241
9.1 FISH技术在微生物群落结构和群落动态研究中的应用 241
9.1.1 FISH技术发展和关键操作环节 241
9.1.2 采用FISH技术鉴定和定量分析特异微生物 243
9.1.3 应用FISH技术监测微生物群落结构、功能和动态 246
9.1.4 FISH技术应用时的主要问题 252
9.2.1 DGGE技术 253
9.2 应用DGGE技术监测微生物群落结构和群落动态 253
9.2.2 DGGE的操作方法 256
9.2.3 应用DGGE技术监测微生物的群落动态 256
9.3 应用SSCP分析技术监测微生物的群落动态 258
9.3.1 SSCP在分析监测微生物群落动态中的可行性 258
9.3.2 应用SSCP分析技术监测微生物的群落动态 258
10环境微生物群落功能基因与表达分析 262
10.1 环境微生物群落功能基因与定位 262
10.1.1 多环芳烃降解基因 262
10.1.2 氨单加氧酶基因 264
10.1.3有机磷水解酶基因 266
10.1.4 酚类化合物降解基因 267
10.1.5脱色相关基因 269
10.1.6其他降解基因 271
10.2 环境微生物群落功能基因表达分析 272
10.2.1 Northern blotting杂交技术 272
10.2.2 蛋白质二维（双向）电泳在降解微生物表达分析中的应用 277
10.2.3 Western blot杂交技术 278
10.2.4 原位PCR的功能基因原位表达分析 283
10.2.5 生物芯片的功能基因原位表达分析 287
11 分子诊断技术与生物信息学 292
11.1 生物信息学研究的主要内容 293
11.1.1 获取人类和各种生物的完整基因组 293
11.1.2 发现新基因和新的单核苷酸多态性 294
11.1.3 研究基因组中非编码蛋白质区域的结构与功能 295
11.1.4 在基因组水平上研究生物进化 296
11.1.5 比较完整的基因组 296
11.1.6 从功能基因组到系统生物学 296
11.1.7 蛋白质结构模拟与药物设计 297
11.2.1 分子生物学数据库 298
11.2 生物信息数据库与查询 298
11.2.2 基因库的Entrez浏览检索 307
11.2.3 BLAST程序 309
11.3 系统进化与序列分析 316
11.3.1 分子进化钟与中性理论 316
11.3.2分子进化树 318
11.3.3 基因组序列信息分析 325
11.4 杂交探针与PCR引物的设计 328
11.4.1 探针和引物设计优化 328
11.4.2探针和引物设计 331
11.4.3 进行分子诊断时常用的分子生物学软件介绍 331
12.1 引起生物安全问题的主要因素 337
12.1.1 生物入侵 337
12分子生物学诊断技术与生物安全性 337
12.1.2 生物多样性的破坏 339
12.1.3 有害生物 340
12.1.4基因流动 340
12.2 转基因生物的安全性 341
12.2.1 转基因植物及其安全性 341
12.2.2 转基因动物及其安全性 345
12.2.3 转基因微生物及其安全性 350
12.2.4 医药生物技术及其产品的生物安全 355
12.3 基于分子生物学诊断技术的生物安全性监测与评价 361
12.3.1 转基因植物安全性监测与评价 361
12.3.2 分子诊断技术用于转基因动物安全性监测与评价 365
12.3.3 分子诊断技术用于转基因微生物安全性监测与评价 368
12.3.4 分子诊断技术用于医药生物技术及其产品的安全性评价 372
参考文献 382