绪论 基因工程药物的发展与对策 1
概述 1
一、国外基因工程药物的现状 2
二、国际医药界竞争与趋势 5
1．全球化兼并浪潮 6
2．美、欧、日三分天下 7
3．今后趋势 9
三、国内基因工程药物的历史与现状 10
1．国内基因工程药物发展的历史 10
2．国内基因工程药物发展的现状 12
3．我国市场上的生物药品 12
四、我国的基因工程新药研发形势严峻 16
1．企业规模过小 16
2．企业一哄而上 16
3．缺乏产业化的接轨机制 16
4．专利保护问题 17
5．基因工程药品种类少、创新能力薄弱 17
6．基因制药支撑产业极其薄弱 17
7．产业化后处理技术落后 17
五、我国基因制药业发展的机遇与对策 18
1．我国生物医药产业面临的发展机遇 18
2．我国基因制药业发展的对策 19
参考文献 21
第一章 基因工程上游构建与原理 23
概述 23
第一节 质粒不稳定性及其措施 23
一、重组分子的结构或分配不稳定性 23
二、质粒拷贝数 24
三、质粒的多聚体形式 25
四、大肠杆菌细胞内有关分裂基因 25
五、质粒的存在对生长的影响 26
六、质粒不稳定性的措施 27
第二节 常见的操纵子 28
一、乳糖操纵子 28
二、trp操纵子 31
三、PL启动子 33
第三节 常用的大肠杆菌表达载体 33
一、pET载体 33
二、携带trp启动子的表达载体 35
三、携带λPL启动子的表达载体 36
第四节 启动子 36
一、保守序列的影响 36
二、Lac启动子及其衍生体 37
三、T7启动子及pET载体 37
四、CspA冷休克启动子 38
五、营养可诱导型启动子 38
六、转录终止子 38
第五节 翻译 39
一、RBS及起始密码子上下游序列 39
二、下游盒子 40
三、翻译终止子 40
四、密码子的影响 40
五、mRNA稳定性 41
第六节 蛋白质的折叠 42
一、细胞质内折叠 42
1．大肠杆菌细胞内环境 42
2．分子伴侣 42
二、周质的折叠 45
1．周质的环境 45
2．Dsb家族蛋白 45
3．周质折叠在重组蛋白表达中的应用 48
第七节 外源基因表达效率的提高 49
一、表达部位 50
1．周质中表达 50
2．胞外表达 52
二、融合蛋白表达 52
1．融合蛋白表达的优点 52
2．融合技术的缺陷 53
3．用于融合蛋白切割的酶 53
三、异源蛋白质的降解问题 53
1．细胞质降解 54
2．周质降解 54
四、异源基因表达后活性的检测 55
参考文献 56
第二章 基因工程菌种库的建立 65
第一节 原始菌种库的建立 65
一、菌种概述 65
二、菌种质量标准 66
三、原始菌种库的建立 67
第二节 主代种子批的建立 68
一、菌种活化 68
二、筛选单菌落菌株 68
三、高表达量菌株的扩增 68
四、主代菌株的冻干 68
五、主代菌种的检定 68
第三节 工作种子批的建立 69
一、菌种的活化 69
二、菌种的扩增 69
三、工作种子批的建立 69
第四节 菌种稳定性 69
一、工程菌菌种的稳定性检测 69
二、质粒的遗传稳定性检测 70
参考文献 72
第三章 大肠杆菌工程菌发酵生产的工艺控制 73
大肠杆菌工程菌发酵工艺控制概述 73
一、概述 73
二、基因工程菌发酵的分类 74
1．间歇式发酵 74
2．分批流加式发酵 75
3．连续式发酵 75
4．透析式发酵 76
5．固定化发酵 76
三、工程菌的代谢过程优化控制 76
1．途径工程和发酵工程的联合控制 76
2．发酵工程和生物反应器的联合控制 76
四、生物反应器类型 77
第一节 大肠杆菌生长原理 78
一、大肠杆菌特性 78
二、大肠杆菌生长原理 79
三、影响大肠杆菌生长的因素 79
1．营养 79
2．温度 80
3．pH 81
4．溶氧 81
5．渗透压 81
6．水活度 82
7．代谢副产物 82
第二节 大肠杆菌工程菌高密度发酵工艺控制原理与方法 83
概述 83
一、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 83
1．工程菌遗传不稳定的表现与机制 84
2．质粒的存在对大肠杆菌宿主菌的生理影响 84
3．质粒不稳定性的防制措施 85
二、包涵体形成的发酵控制 86
1．概述 86
2．包涵体的形成机理 86
3．影响高效表达的重组异源蛋白在大肠杆菌中形成包涵体的因素 86
4．改善包涵体形成的措施 87
三、醋酸形成的机理与防制措施 87
1．醋酸的毒害作用 87
2．醋酸积累的机理 88
3．溢流代谢与混合酸发酵 89
4．菌株特性 90
5．防止醋酸形成的措施 90
四、培养基的优化 91
1．原理 91
2．工程菌培养基设计的基本原则 91
3．大肠杆菌工程菌培养基设计 91
五、流加策略 95
1．流加的目的和意义 95
2．流加的方法 95
六、重组蛋白表达中的高密度发酵溶氧控制 99
1．溶氧（DO）的影响 99
2．溶氧参数KLa和OUR的测定 99
3．KLa和OUR的变化与控制 100
4．溶氧与发酵规模的放大 102
参考文献 105
第四章 嗜甲醇酵母工程菌的发酵生产 112
概述 112
一、嗜甲醇酵母 112
二、毕赤氏巴斯德酵母 112
第一节 毕赤氏巴斯德酵母发酵的重组蛋白生产 113
第二节 汉逊氏多形酵母与巴斯德毕赤氏酵母的重要区别 118
参考文献 120
第五章 基因工程药物的分离纯化技术 122
概述 122
一、蛋白纯化的分离依据 122
二、分离纯化的基本过程 123
第一节 沉淀 124
一、盐析法 125
1．原理 125
2．影响因素 125
3．硫酸铵盐析应该注意的问题 126
二、有机溶剂沉淀法 126
三、等电点沉淀 126
四、非离子多聚物沉淀法 127
第二节 生物技术中的膜分离 127
概述 127
一、微过滤 127
二、标准流动净化 128
三、超滤 128
四、病毒过滤 129
五、高效切线流动过滤 129
六、膜层析 130
第三节 凝胶过滤层析 130
一、凝胶过滤层析的原理 130
二、凝胶过滤层析介质 133
三、凝胶过滤层析的操作 133
1．装填 133
2．检验 134
3．加样 134
第四节 离子交换层析 134
一、离子交换柱层析原理 134
二、离子交换剂种类 135
三、交换容量的测定 136
1．DEAE树脂交换容量的测定 136
2．CM树脂交换容量的测定 136
四、离子交换层析的应用策略 136
1．容量 136
2．起始条件 136
3．pH 137
4．离子强度 137
5．洗脱 137
6．应用实例 138
五、应用实例 138
1．填柱 138
2．平衡 139
3．层析操作 139
第五节 亲和层析 139
一、亲和层析的原理 140
二、亲和层析载体 140
三、载体的处理 141
1．载体的活化 141
2．配体偶联 141
3．间隔手臂 141
4．封闭 141
四、亲和层析操作 142
1．预处理 142
2．上样 142
3．洗涤 142
4．洗脱 142
第六节 蛋白质的保存和真空冷冻干燥 143
一、蛋白质的保存方法 143
1．液态保存 143
2．固态保存 144
二、真空冷冻干燥的原理 144
1．冻干机的组成和冻干程序 144
2．冷冻干燥的程序 145
3．共溶点及其测量方法 146
4．产品的预冻 146
5．产品的第一阶段干燥 148
6．产品的第二阶段干燥 148
7．影响干燥过程的因素 149
8．冻干曲线和时序的制定 150
9．冻干的后处理 152
参考文献 153
第六章 基因工程药物的质量控制 154
第一节 基因工程药物的原材料的质量控制 154
一、对制药用水的质量控制 154
二、活体原料的质量控制 158
三、投产用的化学试剂的质量控制 158
第二节 基因工程药物的中间体的质量控制 158
一、发酵或细胞大量培养过程的质量控制 158
1．遗传稳定性 159
2．产品的产率及产品的稳定性 159
3．防止污染 159
4．培养基质量 160
二、分离纯化过程的质量控制 160
第三节 基因工程药物的原液的质量控制 161
一、原核表达系统生产的基因工程药物原液质控标准 161
二、真核表达系统生产的基因工程药物原液质控标准 161
第四节 基因工程药物的半成品质量控制 162
第五节 基因工程药物的成品质量控制 163
参考文献 163
第七章 基因工程药物的稳定性 164
第一节 稳定性试验 164
一、稳定性报告的内容 164
1．产品的一般资料 164
2．规格标准和检验方法资料研究 164
3．研究设计和研究条件 164
4．稳定性数据（资料） 165
5．数据分析和结论 165
二、稳定性试验设计 165
1．总则 165
2．目的 165
3．批次选择 165
4．包装与容器 165
5．反映稳定性的指标 166
6．试验设置条件 166
7．检测频率 167
8．冻干制品溶解后的稳定性 167
9．加速条件和强力破坏条件 167
第二节 原液（原料药）的稳定性 168
一、批次选择 168
二、样品选择 168
三、试验设置及检测频率 169
四、原液稳定性验证指标 169
1．无保护剂原液样品 169
2．有保护剂原液样品 169
3．强力破坏条件 169
第三节 半成品的稳定性验证 169
一、批次选择 170
二、样品的选择 170
三、试验设置及检测频率 170
四、半成品稳定性验证指标 170
第四节 成品（制剂）的稳定性 170
一、批次选择 170
二、样品的选择 171
三、试验设置及检测频率 171
四、成品（制剂）的稳定性验证指标 171
应用实例 172
第八章 重组人白介素-2 172
第一节 简介 172
一、命名 172
二、生物学活性 172
三、临床应用 172
第二节 结构与性质 173
第三节 重组人白细胞介素-2的工程菌构建 174
第四节 重组人白介素-2的制备 175
一、工艺流程 175
二、发酵 176
1．种子液制备 176
2．发酵培养 176
三、粗纯 176
1．原则 176
2．制备程序 177
四、精纯 178
1．工艺流程 178
2．S-200柱／S-100柱装填 178
3．平衡 179
4．上样 179
5．洗脱 179
6．收样 179
7．柱再生 179
五、复性 179
1．工艺流程 179
2．还原型rIL-2的氧化复性 179
3．影响IL-2的氧化复性的因素 179
六、反向高效液相纯化rIL-2 180
1．RP-HPLC纯化 180
2．旋转蒸发去除乙腈 181
七、纯化结果与分析 181
第五节 重组人白介素-2的质量控制 181
参考文献 183
第九章 重组人干扰素α2b 184
第一节 干扰素简介 184
一、命名及分类 184
二、生物学活性临床应用 184
1．抗病毒作用 184
2．抗肿瘤作用 184
3．免疫调节作用 184
4．消除或修复DNA结构损伤的作用 185
第二节 重组人干扰素的结构与性质 185
第三节 重组人干扰素α2b的制备 185
一、生产工艺流程 185
二、干扰素α2b的发酵 186
1．种子液的制备 186
2．发酵培养 187
三、粗纯 187
1．原则 187
2．细菌的破碎 187
3．包涵体的裂解 187
4．分段稀释法复性 188
5．酸化 188
四、精纯 188
1．DEAE Sepharose F.F层析 188
2．Sepharyl S-100分子筛层析 188
3．CM Sepharose F.F柱层析 189
五、纯化结果分析 190
第四节 重组人干扰素α2b的质量控制标准 190
参考文献 191
第十章 生长素 192
第一节 简介 192
一、命名 192
二、生物学活性 192
三、临床应用 192
第二节 结构与活性 193
第三节 制备 193
一、hGH原料药生产工艺流程图 193
二、发酵培养参数 194
三、粗提 194
四、层析纯化 194
第四节 质量监控标准 195
第十一章 粒／巨噬细胞集落刺激因子 196
第一节 简介 196
一、命名 196
二、生物学活性 196
三、临床应用 196
第二节 结构与功能 197
第三节 制备 197
一、GM-CSF工艺流程及质量控制点 197
二、发酵培养参数 197
三、粗提 197
四、层析纯化 198
第十二章 集落刺激因子 200
第一节 简介 200
一、命名 200
二、生物学活性 200
三、临床应用 200
第二节 结构及活性 201
第三节 制备 201
一、rhG-CSF原料药生产工艺流程图 201
二、酵培养参数 201
三、粗提 201
四、层析纯化 201
第四节 质量监控标准 203
第十三章 促红细胞生成素 204
一、前言 204
二、分子结构及特性 204
三、rhEPO的发酵表达 205
1．工作细胞复苏 205
2．细胞扩增 206
3．表达培养 206
四、rhEPO的纯化 206
五、检定 207
1．活性 207
2．唾液酸含量 207
3．纯度 207
4．相对分子质量 207
5．等电点 207
6．CHO细胞残存蛋白 207
7．牛血清残存量 207
六、rhEPO的临床应用 208
1．慢性肾功能哀竭（CRF） 208
2．HIV感染／ZDU治疗病人 208
3．类风湿性关节炎 208
4．癌性贫血 208
5．早产儿贫血 208
七、EPO的发展 208
第十四章 重组乙型肝炎疫苗 210
第一节 总论 210
一、乙型肝炎病原学 210
二、乙型肝炎的流行病学 211
1．传染源 211
2．传播途径 211
三、乙型肝炎的免疫预防 211
1．接种对象 211
2．用法 211
3．注意事顺 212
4．规格 212
5．有效期 212
四、乙肝肝炎病毒的分子生物学研究 212
1．乙肝病毒表面抗原基因与蛋白成分 212
2．乙肝病毒表面抗原的三种蛋白 212
3．前S1的优势表位 212
4．前S2的优势表位 212
五、各种乙型肝炎蛋白疫苗的评价 213
1．小蛋白疫苗 213
2．中蛋白疫苗 213
3．大蛋白疫苗 213
六、新型疫苗的研制 214
1．抗原表位的意义和特点 214
2．重组乙型肝炎疫苗的自身特点 214
3．乙肝病毒免疫优势表位疫苗的设计和制备 215
七、基因工程乙型肝炎疫苗的表达系统 217
1．大肠杆菌表达系统 217
2．酵母表达系统 217
3．昆虫细胞表达系统 217
4．CHO表达系统 218
5．展望 219
第二节 重组（CHO细胞）乙型肝炎疫苗生产工艺 219
一、工艺流程 219
二、重组CHO细胞的培养 220
1．细胞库的建立 220
2．生产用细胞的全面检定 220
3．生产用主要材料的检定 221
4．培养条件 221
三、重组CHO乙型肝炎疫苗的纯化 222
1．离心纯化法 222
2．柱层析纯化法 223
3．纯化要点 223
第三节 重组CHO乙型肝炎疫苗的质量控制 224
一、疫苗原液的质量标准 224
1．无菌试验 224
2．蛋白含量 224
3．电泳纯度 224
4．高压液相纯度 224
5．牛血清蛋白残留量 224
6．DNA残留量 224
二、半成品的质量控制 224
1．无菌试验 224
2．细菌内毒素含量测定 224
三、成品的质量控制 225
1．鉴别实验 225
2．外观 225
3．无菌试验 225
4．pH值 225
5．氢氧化铝含量 225
6．硫柳汞含量 225
7．游离甲醛含量 225
8．效力试验 225
9．异常毒性试验 225
10．细菌内毒素含量测定 225
参考文献 226
英汉主题词对照 228
汉英主题词对照 234