第一部分 基因工程原理 1
第一章 绪论 1
1.1 基因工程的发展史 1
1.1.1 理论上三个重要的发现 1
1.1.2 技术上三个重要的成果 2
1.2 基因工程的研究内容 3
1.2.1 基因工程 3
1.2.2 基因工程的研究内容 4
1.3 基因工程的应用 5
1.3.1 在医药业的应用 5
1.3.2 在农业方面的应用 8
1.3.3 在畜牧业方面的应用 9
思考题 10
第二章 基因工程的基本操作程序 11
2.1 带有目的基因的DNA片段的制备 11
2.1.1 从已有的生物基因组中分离 11
2.1.2 人工合成法 13
2.2 DNA片段与载体DNA体外重组 15
2.2.1 DNA分子的剪切 15
2.2.2 DNA分子的连接 15
2.2.3 碱性磷酸酶的作用 19
2.3 DNA重组体转入受体细胞 20
2.3.1 受体细胞 20
2.3.2 DNA重组体转入受体细胞 23
2.4 重组体克隆的筛选与鉴定 24
2.4.1 表型直接筛选法 24
2.4.2 菌落或噬菌斑原位杂交 24
2.5 外源基因的表达 25
2.5.1 启动子 25
2.5.2 核糖体结合位点 27
2.5.3 真核基因在大肠杆菌体系中的表达 28
思考题 29
第三章 基因工程的工具酶 30
3.1 引言 30
3.2 剪切酶 31
3.2.1 限制性核酸内切酶 31
3.2.2 核酸外切酶 37
3.2.3 DNA酶 38
3.3 修饰酶 39
3.3.1 磷酸酶 39
3.3.2 甲基化酶 39
3.3.3 聚合酶 40
3.4 连接酶 43
3.4.1 连接反应 43
3.4.2 连接酶 43
思考题 44
第四章 基因工程的载体 45
4.1 质粒 46
4.1.1 一般生物学性状 46
4.1.2 作为载体的特性 47
4.1.3 两种常用的质粒 49
4.1.4 利用质粒进行克隆 54
4.2 噬菌体λ 56
4.2.1 一般生物学特性 56
4.2.2 利用噬菌体λ进行克隆 59
4.2.3 λZAP 64
4.3 单链噬菌体（M13系列） 65
4.3.1 一般生物学特性 65
4.3.2 丝状噬菌体载体及M13载体 67
4.3.3 噬菌体展示系统 70
4.4 粘粒 72
思考题 73
第五章 基因文库的构建 74
5.1 基因组文库 75
5.1.1 原理 75
5.1.2 构建的程序 77
5.2 cDNA文库 82
5.2.1 原理 82
5.2.2 构建的程序 82
5.3 特殊序列文库 85
5.4 酵母人工染色体 87
思考题 89
第六章 聚合酶链反应 90
6.1 基本原理 90
6.1.1 反应过程 91
6.1.2 反应物主要成分 93
6.1.3 基本操作 95
6.2 PCR的种类 96
6.2.1 反向PCR 96
6.2.2 跳跃PCR 97
6.2.3 锚式PCR 98
6.3 应用PCR时的注意事项 99
6.3.1 引物的设计 99
6.3.2 实验操作 101
6.3.3 避免序列的错误扩增 101
6.3.4 污染问题 102
6.4 PCR的应用 102
6.4.1 在医学方面的应用 102
6.4.2 在基础研究方面的应用 104
思考题 105
第七章 人类基因组计划 106
7.1 人类基因组计划的概述 106
7.1.1 人类基因组计划的由来 106
7.1.2 人类基因组计划的目标 107
7.1.3 人类基因组研究的应用 108
7.2 人类基因组研究的主要内容 113
7.2.1 建立遗传图谱 113
7.2.2 建立物理图谱 114
7.2.3 DNA序列测定 115
7.2.4 基因的确定和分析 115
7.3 人类基因组研究的策略 116
7.3.1 人类基因组研究的基本思路 116
7.3.2 确定特定的基因 118
7.3.3 利用染色体特征研究人类基因组 120
7.4 人类基因组研究引发的社会和伦理问题 122
7.4.1 伦理和社会学方面 122
7.4.2 商业与法律方面 124
7.5 人类基因组计划的研究现状与展望 125
7.5.1 研究现状 125
7.5.2 展望 127
思考题 133
第八章 基因工程的安全防护 134
8.1 生物公害 134
8.2 生物公害的控制 135
8.2.1 实验人员适应性训练 135
8.2.2 生物防护 136
8.2.3 物理防护 137
8.2.4 重组体的保管 137
8.3 植物基因工程的潜在危害和防护 138
8.4 中国的《基因工程安全管理办法》 138
8.4.1 适用范围 139
8.4.2 管理体系 139
思考题 140
第二部分 基因工程常用技术 143
第九章 质粒DNA的提取与纯化 143
9.1 概论 143
9.1.1 细菌培养物的培养 143
9.1.2 细菌的收获和裂解 144
9.1.3 质粒DNA的提取和纯化 145
9.2 质粒DNA的小量制备 146
9.2.1 细菌的收获 146
9.2.2 细菌的裂解 147
9.3 质粒DNA的大量制备 150
9.3.1 在丰富培养基中扩增质粒 150
9.3.2 细菌的收获 151
9.3.3 细菌的裂解 151
9.4 质粒DNA的纯化 155
9.4.1 聚乙二醇沉淀法 155
9.4.2 氯化铯—溴化乙锭梯度平衡离心法 157
9.4.3 纯化后的处理 159
第十章 DNA凝胶电泳技术 165
10.1 琼脂糖凝胶电泳 166
10.1.1 概论 166
10.1.2 琼脂糖凝胶的制备及检测 171
10.1.3 DNA的回收与纯化 177
10.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 185
10.2.1 概论 185
10.2.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 187
10.3 其他类型的凝胶电泳 195
10.3.1 链分离凝胶电泳 195
10.3.2 变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 196
10.3.3 脉冲电场凝胶电泳 196
第十一章 RNA分析的主要方法 198
11.1 RNA分析概述 198
11.2 Northern杂交简介 199
11.3 RNA电泳 201
11.3.1 经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳 201
11.3.2 在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳 203
11.4 转膜 205
11.4.1 变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜 205
11.4.2 变性RNA转移至尼龙膜 209
11.5 转膜前后的RNA染色 210
11.5.1 方法Ⅰ 210
11.5.2 方法Ⅱ 210
11.6 杂交和放射自显影 211
第十二章 Southern杂交 213
12.1 概述 213
12.2 基因组DNA的分离 214
12.3 将DNA从凝胶转至固相支持体上 215
12.3.1 转移的方法 215
12.3.2 DNA转移至硝酸纤维素滤膜 218
12.3.3 DNA从凝胶转移至尼龙膜 221
12.4 探针与固定化的核酸杂交 223
12.4.1 探针与固定于膜上的DNA杂交 224
12.4.2 放射性标记的寡核苷酸与基因组DNA杂交 229
12.4.3 从杂交膜上除去放射性标记的探针 231
第十三章 Western印迹法 233
13.1 概述 233
13.2 蛋白样品的制备和电泳 235
13.2.1 裂解哺乳动物细胞和组织 235
13.2.2 电泳 237
13.3 将蛋白质从凝胶转移至固相支持体 238
13.4 对固定化的蛋白质进行染色 241
13.5 封闭杂交膜上的免疫球蛋白结合位点 243
13.6 抗体和靶蛋白的结合 244
13.6.1 第一抗体与硝酸纤维素滤膜共温育的方法 244
13.6.2 二级免疫试剂与硝酸纤维素滤膜共温育的方法 245
13.6.3 酶联抗体生色底物的使用 247
第十四章 DNA序列测定 250
14.1 概述 250
14.1.1 Sanger双脱氧链终止法 251
14.1.2 Maxam-Gilbert DNA化学降解法 255
14.2 随机测序 256
14.2.1 靶DNA的纯化和连接 258
14.2.2 靶DNA的断裂 260
14.2.3 DNA的修补及大小选择 262
14.2.4 载体DNA的制备 263
14.2.5 靶DNA片段与载体DNA连接 264
14.3 定向测序 265
14.3.1 生成若干套嵌套的缺失突变体 265
14.3.2 利用外切核酸酶Ⅲ生成嵌套的缺失突变体 268
14.4 Sanger双脱氧链终止法测序 271
14.4.1 准备 271
14.4.2 配制凝胶 274
14.4.3 加样及电泳 277
14.4.4 测序凝胶的放射自显影 278
14.4.5 从凝胶上读取DNA序列 279
参考文献 281