第1章 序言 1
第1章 为什么要纯化酶？ 3
第1部分 制定纯化流程 9
第2章 蛋白质纯化的策略与考虑因素 9
1.总则 10
2.蛋白质来源 14
3.制备提取物 15
4.大批量纯化步骤 15
5.纯化的精纯过程 16
6.结论 17
参考文献 17
第3章 生物信息学在蛋白质纯化设计中的应用 18
1.氨基酸序列中的重要信息 19
2.无法从序列中预知的信息 22
3.结论 22
参考文献 23
第4章 准备纯化工作简表 24
1.引言 24
2.脚注的重要性 26
3.SDS-PAGE对分析主要蛋白质分离组分的价值 26
4.一些常见的错误和问题 26
第2部分 操作蛋白质和酶的常规方法 31
第5章 建立一个实验室 31
1.配套材料 31
2.检测和分析的必要条件 32
3.蛋白质分级分离的必要条件 33
第6章 缓冲液：原理和实践 35
1.引言 35
2.理论 35
3.缓冲液的选择 37
4.缓冲液的制备 39
5.挥发性缓冲液 40
6.广谱缓冲液 41
7.缓冲液储存液的配方 41
参考文献 48
第7章 酶活性的测定 49
1.引言 49
2.催化活性的原理 50
3.酶活性的检测 54
4.反应分析混合物的组成 57
5.讨论 58
参考文献 58
第8章 蛋白质定量 60
1.引言 61
2.试剂配制的一般性指导 65
3.紫外吸收光谱分析 65
4.基于染料的蛋白质分析方法 67
5.考马斯亮蓝蛋白质浓度分析法（范围：1～50μg） 69
6.碱性铜还原分析法（范围：5～100μg） 70
7.二喹啉酸法（范围：0.2～50μg） 71
8.胺衍生法（范围：0.05～25μg） 72
9.基于去污剂的荧光检测（范围：0.02～2μg） 73
10.总论 74
参考文献 76
第9章 蛋白质浓缩和溶质的去除 78
1.层析 79
2.电泳 82
3.透析 83
4.超滤 85
5.冷冻干燥 89
6.沉淀 91
7.结晶 92
参考文献 92
第10章 蛋白质稳定性的保持 94
1.蛋白质失活的原因 94
2.常规处理方法 95
3.浓缩和溶剂条件 95
4.稳定性实验和储存条件 96
5.蛋白质水解和蛋白酶抑制剂 96
6.蛋白质活性丢失 97
第3部分 重组蛋白的表达与纯化 101
第11章 选择重组蛋白表达的合适方法 101
1.引言 102
2.大肠杆菌 102
3.毕赤酵母 104
4.杆状病毒/昆虫细胞 105
5.哺乳动物细胞 106
6.蛋白质的特性 108
7.重组蛋白的应用 109
8.结论 110
参考文献 111
第12章 用于外源蛋白生产的细菌表达系统 114
1.引言 115
2.使用大肠杆菌生产外源蛋白 115
3.设计一个细菌表达方案 116
4.方案需求的评估 116
5.目标蛋白质的分析 116
6.克隆 117
7.制备T4 DNA聚合酶处理的DNA片段 118
8.大肠杆菌细胞质中的表达 119
9.大肠杆菌细胞质中目标蛋白质的表达 119
10.大肠杆菌中表达的外源蛋白质的分析 120
11.使用自诱导培养基方案的小量表达培养 122
12.蛋白质的周质表达 123
13.大肠杆菌周质腔中目标蛋白质的表达 123
14.小规模渗透休克法 123
15.用于外源蛋白质生产的其他细菌系统 125
16.其他载体和诱导条件 126
17.生产规模 126
参考文献 127
第13章 毕赤酵母中的表达 129
1.引言 130
2.其他真菌表达系统 130
3.培养基和微生物操作技术 131
4.遗传株的构建 131
5.基因制备和载体选择 133
6.电穿孔转化法 134
7.DNA的制备 135
8.重组蛋白表达菌株的鉴定 137
9.分析方法的建立——酵母印迹法 139
10.重组蛋白的翻译后修饰（蛋白酶和糖基化） 140
11.挑选具有多拷贝表达框的克隆 141
参考文献 142
第14章 杆状病毒-昆虫细胞表达系统 144
1.引言 145
2.杆状病毒生物学和分子生物学的简要回顾 145
3.杆状病毒表达载体 147
4.杆状病毒表达载体技术——早期 147
5.杆状病毒表达载体技术——改进 149
6.杆状病毒转移质粒的改进 149
7.亲代杆状病毒基因组的改进 150
8.杆状病毒-昆虫细胞系统的另一半 157
9.杆状病毒表达载体的新一代昆虫细胞宿主 158
10.杆状病毒的基本操作方案 160
参考文献 163
第15章 哺乳动物细胞瞬时基因转移法制备重组蛋白 167
1.引言 167
2.TGE方法中常用的HEK293和CHO细胞系 168
3.用于HEK293和CHO细胞的表达载体 170
4.HEK293和CHO细胞系的悬浮培养 171
5.转染方法 171
6.结论 175
参考文献 176
第16章 用于蛋白质表达的标签 180
1.引言 181
2.设计具有标签的蛋白质时需要考虑的因素 183
3.蛋白质亲和标签 185
4.可溶性标签 188
5.标签的去除 190
6.结论 192
参考文献 192
第17章 包涵体蛋白溶解后的重折叠 197
1.引言 198
2.重折叠时通常需要考虑的因素 199
3.常规流程 200
4.常规操作方案 200
5.对该常规操作流程的评论 202
6.蛋白质重折叠条件的筛选实验 207
7.其他的重折叠流程 210
8.重折叠数据库：REFOLD 211
9.提高可溶性蛋白比例的策略 212
10.结论 213
参考文献 213
第4部分 提取物和亚细胞组分的制备 219
第18章 蛋白质纯化所需的生物提取物制备的研究进展 219
1.引言 220
2.化学法和酶法细胞裂解 220
3.机械法裂解细胞 223
4.结束语 225
5.细胞裂解的流程、试剂和技巧 225
参考文献 231
第19章 亚细胞器及亚细胞结构的分离 234
1.引言 235
2.亚蛋白质组的提取和初步分离 237
参考文献 253
第5部分 纯化程序：量产法 257
第20章 蛋白质沉淀技术 257
1.引言 258
2.AS沉淀 258
3.PEI沉淀 262
4.其他方法 265
5.沉淀分离蛋白质的常规操作 265
参考文献 266
第21章 用于去除核酸的Affi-Gel BLUE和核苷酸结合蛋白质的初步富集 267
1.典型的方案 268
参考文献 269
第6部分 纯化程序：层析方法 273
第22章 离子交换层析 273
1.引言 273
2.原理 275
3.固定相 277
4.结合条件 278
5.洗脱条件 281
6.离子交换层析柱的操作 283
7.实例：复杂蛋白质混合物的分离 285
8.实例：采用整体柱进行高分辨率的分离 288
参考文献 289
第23章 凝胶过滤 290
1.原理 290
2.操作 291
第24章 羟基磷灰石柱用于蛋白质层析 299
1.引言 300
2.机制 300
3.化学特性 302
4.纯化操作规程的开发 306
5.实验室规模层析柱的填装 307
6.生产规模层析柱的填装 308
7.应用 309
参考文献 311
第25章 疏水作用层析在蛋白质纯化中的理论及应用 313
1.原理 313
2.HIC吸附剂的最新技术 315
3.HIC吸附剂的使用方法 316
参考文献 319
第7部分 纯化程序：亲和法 323
第26章 亲和层析：常规方法 323
1.引言 324
2.亲和介质的选择 325
3.配基的选择 327
4.化学吸附作用 331
5.纯化方法 334
参考文献 335
第27章 固定化金属亲和层析：综述 338
1.IMAC配基和固相离子的概况 339
2.IMAC的应用 342
3.结论 359
参考文献 360
第28章 多羟基反应单克隆抗体的鉴定、生产和使用——用于免疫亲和层析 365
1.引言 366
2.多羟基反应单克隆抗体 366
3.结论 377
参考文献 378
第8部分 纯化方法：电泳法 383
第29章 单向凝胶电泳 383
1.背景 384
2.聚丙烯酰胺凝胶 385
3.方法原理 386
4.步骤 387
5.凝胶中蛋白质的检测 391
6.蛋白质分子质量标准 393
7.分子质量测定 393
8.制备型电泳 394
参考文献 395
第30章 等电聚焦和二维凝胶电泳 396
1.引言 397
2.材料 405
3.方法 406
参考文献 414
第31章 蛋白质凝胶染色法：介绍与概述 416
1.介绍 417
2.常规考虑 418
3.仪器：检测和记录 419
4.总蛋白质的检测 419
5.磷蛋白的检测 427
6.糖蛋白的检测 428
参考文献 430
第32章 凝胶中蛋白质的洗脱 433
1.引言 433
2.通过扩散来洗脱凝胶中的蛋白质 434
3.用反相HPLC代替SDS凝胶电泳法 437
4.电泳洗脱 437
5.总结 437
参考文献 438
第33章 Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测 439
1.蛋白质印迹法 440
2.蛋白质印迹法的种类 441
3.检测方法 444
4.化学发光信号 446
5.常见问题及其原因 449
6.使用化学发光底物的印迹法和操作规程的优化 453
参考文献 457
第9部分 膜蛋白和糖蛋白的纯化程序 461
第34章 去污剂：综述 461
1.引言 462
2.去污剂结构 462
3.溶液中去污剂的性质 468
4.利用去污剂的物理化学参数进行膜蛋白的纯化 470
5.去污剂的去除及置换 471
6.选择合适的去污剂 471
7.结论 473
参考文献 473
第35章 膜蛋白的纯化 475
1.引言 475
2.膜的制备 476
3.天然膜蛋白的增溶 477
4.膜蛋白的纯化 479
5.去污剂的去除和置换 480
6.重组整合膜蛋白的表达和纯化 481
参考文献 481
第36章 重组G蛋白偶联受体的纯化 483
1.引言 484
2.蛋白质增溶的一般注意事项 484
3.蛋白质纯化的一般注意事项 485
4.增溶和纯化重组神经降压肽受体NTS1 487
5.纯化的NTS1分析 490
6.总结 491
参考文献 491
第37章 整合膜蛋白在单室脂质体中的无细胞翻译 494
1.引言 495
2.无细胞翻译系统概述 496
3.表达载体 497
4.基因克隆 498
5.PCR产物纯化 500
6.Flexi载体和PCR产物酶切反应 501
7.连接反应 501
8.转化反应 502
9.质粒DNA的纯化 503
10.mRNA制备 504
11.脂质体的制备 504
12.小麦胚芽翻译反应 505
13.密度梯度超速离心纯化 507
14.脂蛋白体的性质 509
15.规模化的注意事项 510
16.同位素标记进行结构研究 510
17.总结 511
参考文献 511
第10部分 纯化蛋白质的特性 517
第38章 蛋白质纯度测定 517
1.蛋白质的组成和活性分析 519
2.电泳法 520
3.色谱法 522
4.沉降速率测定法 523
5.质谱法 524
6.光散射法 524
参考文献 525
第39章 蛋白质亚基的存在及其大小和分子质量的测定 526
1.引言 527
2.化学方法 528
3.传输方法 530
4.散射方法 543
5.蛋白质亚基的存在 544
参考文献 546
第40章 翻译后修饰蛋白质的定性和定量 548
1.引言 549
2.用于鉴定PTM的富集技术 552
3.蛋白质的硝化修饰 559
4.甲基化和乙酰化 560
5.质谱分析 561
6.CID、ECD和ETD的对比 563
7.PTM的定量分析 566
8.展望 570
参考文献 571
第11部分 其他技术 579
第41章 表达与纯化的平行方法 579
1.引言 579
2.基于最终用途的策略 580
3.用于构建表达构建体的平行克隆策略 582
4.小规模表达筛选以鉴定合适的构建体 584
5.用于选择的蛋白质的分析测试 587
6.大规模平行表达 588
7.总结 591
参考文献 591
第42章 氧敏感蛋白的分离技术：以［4Fe-4S]-FNR为例 593
1.引言 594
2.4Fe-FNR的厌氧分离 595
3.含FNR的［4Fe-4S］2+族蛋白质的特征 601
4.总结 604
参考文献 605
第12部分 结束语 609
第43章 纯化程序的再思考 609
1.介绍 609
第44章 蛋白质生物化学中重要的却鲜为人知（或易被忽略）的几点 611
1.引言 611
2.SDS凝胶电泳样品的制备 612
3.缓冲液 613
4.色谱 614
5.过滤过程中的蛋白质吸收 615
6.塑料制品中的化学物浸出 615
7.尿素中的氰酸盐 615
参考文献 616
索引 617