第1章 绪论 1
1.1 基因与基因工程 1
1.1.1 基因的概念 1
1.1.2 基因工程的诞生与发展 3
1.1.3 基因工程的研究内容 4
1.1.4 基因工程与生物工程的关系 8
1.2 基因工程的操作和应用 9
1.2.1 基因工程的操作流程 9
1.2.2 基因工程的应用 9
1.3 基因工程的安全性 15
1.3.1 基因工程的安全隐患 15
1.3.2 重组DNA研究的安全措施 15
1.3.3 转基因产品的消费安全性 17
思考题 17
第2章 生物大分子——核酸与蛋白质 19
2.1 核酸的结构与性质 19
2.1.1 核苷酸 19
2.1.2 DNA的结构 20
2.1.3 RNA的结构 22
2.1.4 核酸的性质 24
2.1.5 核酸的定量和纯度测定 25
2.2 蛋白质的结构和性质 30
2.2.1 蛋白质的一级结构 30
2.2.2 蛋白质的二级结构 31
2.2.3 蛋白质的三级结构 33
2.2.4 蛋白质的性质 33
2.3 基因的组织 34
2.3.1 原核生物基因的结构 35
2.3.2 真核生物基因的结构 35
2.4 大分子间的信息传导 37
2.4.1 DNA的复制 37
2.4.2 遗传信息的转录 38
2.4.3 RNA的翻译 42
思考题 47
第3章 基因工程的工具酶 48
3.1 限制性核酸内切酶 48
3.1.1 寄主的限制和修饰现象 48
3.1.2 限制性核酸内切酶的类型 50
3.1.3 限制性核酸内切酶的命名 56
3.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素 57
3.1.5 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 59
3.1.6 限制性核酸内切酶反应的终止 60
3.2 DNA修饰酶 61
3.2.1 核酸酶 61
3.2.2 聚合酶 62
3.2.3 修饰DNA分子末端的酶 64
3.3 DNA连接酶 65
3.3.1 大肠杆菌和T4噬菌体的DNA连接酶 65
3.3.2 影响连接反应的因素 67
思考题 68
第4章 目的基因的获得 70
4.1 从基因组DNA中获得目的基因 70
4.1.1 碱抽提法提取质粒DNA 70
4.1.2 层析法获得细胞总RNA 74
4.2 从基因文库中筛选目的基因 75
4.2.1 基因组文库的构建 75
4.2.2 cDNA文库的构建 78
4.3 化学法合成目的基因 84
4.3.1 磷酸二酯法 84
4.3.2 亚磷酸三酯法 84
4.3.3 寡核苷酸的连接 86
4.4 通过PCR获得目的基因 87
思考题 87
第5章 基因扩增 89
5.1 PCR技术 89
5.1.1 PCR技术的发明 89
5.1.2 PCR技术的原理 90
5.1.3 PCR技术的特点 92
5.2 聚合酶链式反应的最适条件 93
5.2.1 Taq DNA聚合酶 93
5.2.2 引物 98
5.2.3 模板 101
5.2.4 dNTP 102
5.2.5 Mg2＋浓度 102
5.2.6 PCR系统中的其他成分 102
5.2.7 PCR的热循环计划 102
5.3 聚合酶链式反应技术的应用 104
5.3.1 基因克隆 104
5.3.2 反向PCR与染色体步移 105
5.3.3 不对称PCR与DNA序列测定 106
5.3.4 RT-PCR与RNA分析 108
5.3.5 实时定量PCR与基因表达分析 109
思考题 110
第6章 基因的体外重组 111
6.1 基因克隆策略 111
6.2 克隆载体 112
6.2.1 质粒载体 112
6.2.2 噬菌体载体 128
6.2.3 柯斯质粒载体 144
6.2.4 人工染色体载体 148
6.3 DNA的连接 152
6.3.1 DNA片段在体内和体外的连接——黏性末端的连接 152
6.3.2 平齐末端的连接 153
6.3.3 TA克隆 158
思考题 160
第7章 基因的转移与重组体的检测 162
7.1 重组体向寄主细胞的导入 162
7.1.1 重组体DNA分子的转化或转染 162
7.1.2 λDNA的体外包装 164
7.1.3 体外包装的λ噬菌体的转导 166
7.2 重组体克隆的筛选与鉴定 168
7.2.1 遗传检测法 169
7.2.2 物理检测法 175
7.2.3 核酸杂交筛选法 176
7.2.4 免疫化学检测法 179
7.2.5 DNA-蛋白质筛选法 185
思考题 185
第8章 外源基因在原核细胞中的表达 187
8.1 原核生物基因表达的特点 187
8.2 原核基因表达的调控序列 189
8.3 原核表达载体 195
8.4 提高克隆基因表达效率的途径 198
思考题 208
第9章 酵母的基因工程 210
9.1 酵母基因的克隆 210
9.1.1 酵母基因克隆载体——穿梭质粒 211
9.1.2 利用大肠杆菌突变互补法克隆酵母生物合成基因 216
9.1.3 用简单的互补法克隆酵母基因 218
9.2 以酵母为材料对真核生物功能的研究 220
9.2.1 酵母的同源重组 220
9.2.2 用酵母研究高等生物基因的信号通路 224
9.2.3 用酵母研究真核细胞核内小分子RNA U2的功能 227
9.2.4 用酵母研究真核细胞蛋白质-蛋白质相互作用 228
思考题 229
第10章 转基因植物 230
10.1 植株再生 230
10.1.1 植物在遗传工程方面的优缺点 230
10.1.2 原生质体再生植株 231
10.1.3 叶盘再生植株 233
10.2 植物基因转移的途径 234
10.2.1 土壤农癌杆菌的Ti质粒引起冠瘿瘤 234
10.2.2 Ti质粒的T-DNA部分转移至植物细胞 235
10.2.3 T-DNA经过改造后作为基因工程载体 236
10.2.4 植物基因转移的方式 238
10.2.5 用报告基因证明转移基因在植物组织中的表达 241
10.2.6 病毒作为植物基因转移的载体 242
10.2.7 用基因枪和电击法将DNA转移入植物细胞 244
10.2.8 用DNA包裹的粒子轰击可产生转基因细胞器 245
10.3 转基因植物基因的表达 247
10.3.1 植物表达抗感染的病毒外壳蛋白 247
10.3.2 植物表达微生物毒素以阻止昆虫蚕食 249
10.3.3 抗除草剂植物 251
10.3.4 转基因花卉植物 253
10.3.5 利用转基因植物生产有重要价值的蛋白质 254
思考题 255
第11章 哺乳动物细胞的基因工程与转基因动物 257
11.1 哺乳动物细胞的基因转移 257
11.1.1 永久性细胞系的建立与基因转移 257
11.1.2 哺乳动物细胞的选择性标记 257
11.1.3 哺乳动物细胞基因转移的途径 259
11.1.4 转基因哺乳动物细胞基因的表达 266
11.2 转基因小鼠 276
11.2.1 转基因小鼠的微注射途径 276
11.2.2 转基因小鼠的胚胎干细胞途径 278
11.2.3 转基因的组织特异性表达 281
11.2.4 转基因小鼠的应用 281
11.3 转基因家畜 285
11.3.1 重组牛生长激素促进动物泌乳和改善饲料利用率 285
11.3.2 转基因家畜 286
11.3.3 用转基因动物生产药物蛋白 287
11.3.4 通过转基因表达病毒外壳蛋白以保护家畜免受病毒感染 289
思考题 289
第12章 基因工程与药物蛋白生产 291
12.1 利用基因工程技术生产胰岛素和生长激素 291
12.1.1 生产重组蛋白的表达系统 291
12.1.2 重组人胰岛素的生产 292
12.1.3 重组人生长激素的生产 293
12.2 利用基因工程技术生产疫苗和其他复杂蛋白质 295
12.2.1 乙型肝炎病毒疫苗的生产 295
12.2.2 用哺乳动物细胞大规模生产人的复杂蛋白质 297
12.3 利用基因工程技术生产抗体 298
12.3.1 单克隆抗体 298
12.3.2 对识别特异性抗原的抗体直接克隆和选择 300
12.3.3 单克隆抗体的人源化 301
12.3.4 双特异性抗体 303
12.3.5 小分子抗体 304
思考题 306
第13章 基因诊断与基因治疗 307
13.1 基因诊断 307
13.1.1 基因诊断的特点和对象 307
13.1.2 基因诊断技术 308
13.1.3 基因诊断的应用示例 311
13.2 基因治疗 313
13.2.1 基因治疗的发展过程及基本策略 313
13.2.2 反义核酸技术与基因治疗 318
13.2.3 RNA干扰与基因治疗 321
13.2.4 核酶与基因治疗 323
思考题 328
第14章 基因工程与社会伦理道德 329
14.1 基因工程与宗教信仰和非政府组织的冲突 329
14.2 基因工程在医学领域的伦理道德问题 330
14.3 基因工程技术本身的社会伦理道德问题 331
14.3.1 转基因食品的安全问题 332
14.3.2 转基因的环境安全问题 334
14.3.3 克隆技术的安全问题 334
14.3.4 基因工程的其他社会和伦理道德问题 335
思考题 336
参考文献 337