第一章 生物大分子物质的制备 1
第一节 材料的选择与处理 1
一、有效成分的特性 1
第一编 概论 1
二、材料选择的一般原则 2
三、材料的处理 2
1．动物脏器 2
2．植物组织 3
3．微生物 3
第二节 建立测定方法 3
一、目的与要求 3
二、测定方法 4
1．光谱法 4
2．电化学法 4
2．组织捣碎器法 5
3．超声波法 5
第三节 细胞的破碎 5
1．研磨法 5
一、机械破碎 5
4．压榨法 6
5．冻融法 6
二、溶胀和自溶 6
1．溶胀 6
2．自溶 6
三、化学处理法 6
四、酶法 7
第四节 抽提 7
一、抽提方法 7
二、影响抽提有效成分的因子 7
1．pH值 7
3．蛋白酶或核酸酶 8
2．溶剂的极性和离子强度 8
4．温度 9
5．搅拌 9
6．氧化 9
7．金属离子 10
8．抽提液与抽提物的比例 10
第五节 浓缩 10
一、沉淀法 10
二、吸附法 10
三、超过滤法 11
四、透析浓缩法 11
五、减压蒸馏浓缩法 12
六、冰冻干燥法 12
第六节 纯化方案的设计原则 13
一、纯化方案的选择 13
二、纯化方案的评价 13
第七节 有效成分的纯度和性质的分析 16
第八节 实例 17
一、制备高纯度的人转铁蛋白的快速方法 17
二、叶绿体的提取与4.5SRNA的制备 17
三、细菌质粒DNA的提取 18
第二编 纯化方法 19
第二章 沉淀法 19
第一节 基本原理 19
第二节 沉淀的类型及操作 19
一、盐析法 19
1．盐的分级沉淀 20
2．盐析曲线的制作 21
3．影响盐析的因子 23
4．脱盐 26
二、有机溶剂沉淀法 27
三、蛋白质沉淀剂 28
四、聚乙二醇沉淀作用 29
3．重金属 29
1．碱性蛋白质 29
2．凝集素 29
五、选择性沉淀法 30
六、结晶 30
第三节 实例 31
一、脾磷酸二酯酶的纯化 31
1．丙酮粉的制备 31
2．第一次硫酸铵分级分离 32
3．第二次硫酸铵分级分离 32
4．丙酮分级分离 32
第三章 吸附层析法 34
第一节 吸附柱层析 36
一、常用述语（对所有层析都适用） 36
1．固定相 36
6．外水体积 37
8．基质体积 37
7．内水体积 37
3．操作容量 37
5．洗脱体积 37
4．床体积 37
2．流动相 37
9．膨胀度 38
10．分配系数和迁移率 38
二、基本原理 38
三、吸附剂 39
1．吸附剂的选择 39
2．吸附剂的性质 39
四、洗脱剂 42
五、层析柱的制备及层析操作 43
2．吸附剂的用量 44
3．装柱 44
1．层析柱 44
4．上样和洗脱 45
5．吸附剂的再生 46
六、应用与实例 46
1．应用 46
2．实例 47
第二节 薄层层析法 49
一、具体操作及注意事项 51
1．薄层板的制备 51
2．点样 54
3．展层 54
4．显色 57
二、实例 62
第三节 聚酰胺薄膜层析法 63
一、基本原理 64
二、DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜层析 65
1．试剂及样品的制备 66
2．展层剂与展层 67
3．注意事项 67
三、DABTH-氨基酸的薄层法在蛋白质顺序分析中的应用 69
1．DABTH-氨基酸的制备 71
2．DABITC在手工液相测定顺序法中的应用 71
3．利用薄层法测定DABTH-氨基酸 71
第四章 分配层析法—纸层析法 75
第一节 基本原理 75
第二节 影响Rf值的主要因素 76
一、分离物的结构 76
二、流动相（展层剂） 77
1．性质 77
2．组成 77
3．pH值 77
四、滤纸的性质 78
三、温度 78
1．滤纸的选择 79
2．滤纸的处理 79
第三节 应用 79
一、氨基酸的定性分析 79
1．样品制备和点样 79
2．双向层析 80
3．显色 81
4．测Rf值 81
二、氨基酸的定量分析 81
1．比色法 81
2．光密度法 81
第五章 离子交换层析 84
第一节 基本原理 84
第二节 离子交换剂的分类及其性质 87
1．疏水性离子交换剂 88
一、分类 88
2．亲水性离子交换剂 90
二、性质 95
1．颜色与形状 95
2．交联度 96
3．吸水量或膨胀度 96
4．交换容量 99
6．比重 102
5．稳定性 102
7．流速 103
第三节 离子交换剂与缓冲液的选择 106
一、离子交换剂的选择 106
1．对阴、阳离子交换剂的选择 106
2．对强、弱离子交换剂的选择 107
3．对不同离子型交换剂的选择 107
4．对不同基质离子交换剂的选择 107
2．缓冲液离子强度和pH值的选择 108
二、缓冲溶液的选择 108
1．缓冲液组分的选择 108
第四节 操作 110
一、离子交换剂的处理、再生和转型 110
二、分离物质的交换 111
三、物质的洗脱与收集 112
第五节 应用 115
一、制备、纯化生物物质 116
1．用强阳离子交换剂树脂732分离四种核苷酸 116
2．用离子交换法从胰酶水解的肠粘膜液中提取肝素钠 117
3．用DEAE-纤维素22层析法纯化解酚假单胞菌邻苯二酚-2、3-双加氧酶 118
二、测定蛋白质的等电点 119
第六章 凝胶过滤 122
第一节 凝胶的分类及性质 122
一、葡聚糖凝胶 122
1．理化性质 124
2．（稳定性） 125
3．吸附性 125
二、琼脂糖凝胶 128
三、聚丙烯酰胺凝胶 131
四、Sephacryl 132
第二节 基本原理 134
第三节 操作 137
一、凝胶的选择和处理 137
1．凝胶的选择 137
2．凝胶用量的计算 138
3．凝胶的处理 138
二、凝胶柱的制备 139
1．柱的选择 139
1．加样 141
三、加样、洗脱和测定 141
3．凝胶柱的鉴定 141
2．装柱 141
2．洗脱 144
四、凝胶柱的再生和处理 146
1．再生 146
2．脱水处理 147
第四节 应用 149
一、脱盐和浓缩 149
二、分离提纯 149
三、去热源物质 150
四、测定分子量 150
1．用凝胶柱层析制作测定蛋白质分子量的标准曲线的方法 152
2．用葡聚糖凝胶薄板测定蛋白质分子量 154
五、其它 156
第七章 亲和层析 159
第一节 基本原理 160
第二节 操作 163
一、基质的选择 163
二、配体的选择 164
1．对欲纯化的大分子物质具有较强的亲和力 164
2．具有一个与基质共价结合的基团 166
三、亲和吸附剂的制备 166
1．活化 166
2．偶联 169
3．配体结合量的测定 170
四、特异性的吸附 171
五、大分子物质的分离 174
六、亲和层析柱的再生 176
第三节 提高吸附剂与大分子物质亲和力的途径 177
一、在配体和基质之间引入“手臂（arms） 177
1．原理 177
2．吸附剂衍生物的制备 178
三、配体与基质以最少的键连接 179
二、增加配体取代的程度 179
四、基质多孔性的影响 180
五、其它 183
第四节 应用 183
一、分离纯化大分子物质 183
1．纯化抗体、抗原及其复合物 183
2．分离纯化糖蛋白 185
3．分离巯基蛋白 185
4．分离核酸 185
5．其它 185
二、研究酶的结构与功能 188
一、多缓冲剂和多缓冲交换剂 190
1．多缓冲剂 190
第一节 基本原理 190
第八章 聚焦层析 190
2．多缓冲交换剂 191
二、聚焦层析的原理 192
1．pH梯度溶夜的形成 193
2．蛋白质的行为 193
3．聚焦效应 194
一、选择多缓冲交换剂及相应的缓冲液 196
第二节 操作 196
二、多缓冲交换剂用量的选择 197
三、多缓冲交换剂的处理 200
四、样品的准备 200
五、上样和洗脱 201
六、分离后的样品中多缓冲剂的去除 201
第三节 应用 201
一、分离模型蛋白质 202
1．分离鸡蛋白组分 203
二、分离复杂的物质 203
2．分离糜鹿肌肉匀浆液中的蛋白质 204
3．鉴定铁氧（化）—还（原）蛋白—NADP+氧化还原酶的某些特性 205
第九章 气相色谱 208
第一节 基本原理 210
一、常用述语 210
1．载气 210
2．担体 210
3．固定液 211
4．死时间、保留时间和校正保留时间 211
5．死体积 211
8．分离度 212
二、原理 212
6．滞甾因子 212
7．基线 212
第二节 气相色谱仪的构造 213
一、气源、载气流速的控制和测量 214
二、进样系统 214
三、恒温室 215
四、色谱柱 215
1．柱的形状及分类 215
2．担体 216
3．固定液的分类及选择 217
五、检定器 221
1．热导池检定器 221
4．色谱柱的制备 221
2．氢火焰离子化检定器 223
第三节 操作 224
一、操作要点 224
二、操作条件的选择 224
1．载气流速 224
2．几个峰重叠在一起 225
4．色谱峰不规则 225
3．分析时间过长 225
三、故障的分析与排除 225
1．分离不完全 225
3．进样量和进样速度 225
2．柱温 225
第四节 定性和定量分析方法 226
一、定性分析方法 226
1．利用校正保留值定性 226
2．利用“加入法”定性 227
3．利用保留值与化合物结构之间的关系定性 227
二、定量分析方法 228
2．定量方法 229
第五节 应用 233
一、蛋白质和氨基酸的分析 233
三、糖类的分析 234
四、脂肪酸的分析 234
二、核酸的分析 234
五、农药的分析 237
第十章 高效液相色谱 239
第一节 基本原理 239
第二节 应用 242
一、定性和定量分析 242
二、酶活性的测定 244
三、蛋白质分子量的测定 247
1．用反相HPLC分离核苷酸 248
2．用高效液相离子交换色谱分离核糖核蛋白复合物 248
四、分离纯化核酸和蛋白质 248
3．用高效聚焦色谱分离几种碱性谷胱甘肽转移酶的同功酶 249
五、附表 251
第十一章 固定化的酶和微生物 257
第一节 制备方法 258
一、固定化酶 258
1．载体结合法 258
2．交联法 264
3．包埋法 264
二、固定化微生物 265
第二节 制品的性质 265
一、酶的相对活力 265
二、活力曲线与最适pH 268
三、稳定性 272
四、米氏常数 273
五、其它 276
第三节 应用 277
一、工业方面 277
二、医学方面 279
三、生化分析方面 281
1．自动分析 281
2．酶电极 282
3．分析生物大分子物质的结构 283
4．研究酶的功能和反应机理 284
5．亲和层析 284
四、应用实例 285
1．固定化5′-磷酸二酯酶的制备方法（重氮法） 285
3．固定化抗坏血酸氧化酶的制备方法（肽法） 288
1．（校正因子的概念） 288
2．固定化具有葡萄糖异构酶活性菌体的制备方法（交联法） 288
第三编 鉴定方法 290
第十二章 电泳法 290
第一节 基本原理 292
一、材料准备 295
1．电泳槽 295
第二节 纸电泳 295
2．缓冲液的选择 296
3．滤纸的选择和剪裁 296
二、点样 298
1．点样位置和形状 298
2．点样量 298
3．点样方法 299
三、电泳 299
四、烘干 300
五、显色 300
六、定量测定法 300
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 303
一、基本原理 304
1．聚丙烯酰胺的合成 306
2．分离效应 310
1．不连续垂直柱状凝胶电泳 313
二、操作 313
2．不连续垂直板凝胶电泳 326
3．连续的盘状凝胶电泳和垂直板凝脉电泳 328
4．线性或阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 332
5．双向电泳 337
第四节 琼脂电泳 340
一、基本原理 340
二、操作 340
1．缓冲液的配制 340
2．琼脂糖凝胶板的制备 340
3．加样 341
4．电泳 341
5．观察 342
三、应用实例 342
第五节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 343
一、基本原理 343
1．凝胶浓度的选择 344
二、操作 344
2．样品的制备 345
3．电泳条件 345
4．固定 345
5．染色 345
6．计算迁移率（Rf值） 346
第六节 聚丙烯酰胺凝胶电聚焦 346
一、基本原理 347
二、两性电解质的理化性质 348
1．缓冲性能强 349
2．导电性能好 349
3．分子量小 349
4．紫外吸收值低 349
5．一般与分离样品不起化学反应 349
三、两性电解质的PH范围及用量的选择 350
四、测定蛋白质等电点的操作 351
1．凝胶配制 351
2．加样 353
3．聚焦 353
4．固定与染色 353
5．样品PH的测定 353
6．蛋白质的洗脱 355
7．等电点的测定 356
第七节 印迹法（或转移电泳） 356
一、基本原理 357
二、操作及注意事项（以蛋白质为例） 358
1．蛋白质的分离 358
2．印迹 358
3.鉴定 359
1．分析和制备特异成分 361
2．检测生物大分子物质之间的相互作用 361
三、应用 361
3．实例 362
第十三章 免疫化学法 365
第一节 抗体的性质、制备及纯化 365
一、抗体的性质 365
二、多克隆抗体的制备 367
1．抗原 367
2．免疫 373
三、单克隆抗体的制备 385
1．单克隆抗体产生的机理 386
2．操作 387
四、抗体的纯化 389
1．硫酸铵分离法 389
2．DEAE—纤维素层析法 390
第二节 抗原与抗体的特异性反应 391
5．SPA—Sepharose亲和层析法 391
3．ConA—Sepharose4B柱层析法 391
4．抗原—Sepharose亲和层析法 391
一、同位素标记法 392
1．同位素的选择 392
2．标记操作 393
3．鉴定抗原与抗体 398
二、酶标记法 400
1．酶制品 400
三、荧光标记法 401
2．标记操作 401
1．标记 402
2．游离荧光素的去除 402
3．保存 402
4．检测 402
第三节 免疫扩散法 402
一、基本原理 402
1．操作 403
二、双向免疫扩散法 403
2．沉淀弧图谱的分析 405
3．注意要点 405
第四节 免疫电泳法 406
一、试验材料的准备 406
二、微量多槽免疫电泳 409
1．基本原理 409
2．操作 409
3．沉淀弧的识别 411
三、对流免疫电泳 412
四、火箭免疫电泳 413
1．基本原理 413
2．操作 413
五、交叉免疫电泳与亲和电泳 416
第一节 基本原理 420
第十四章 离心 420
第四编 仪器及应用 420
第二节 离心机的类型及主要构造 423
一、制备离心机 423
1．普通离心机 424
2．高速离心机 424
3．超速离心机 425
二、分析离心机 426
第三节 应用 428
一、分离制备样品 428
1．差速分级离心法 428
2．区带离心法 429
二、沉降系数的测定 433
第十五章 分光光度法 436
第一节 基本原理 437
一、光谱 437
二、物质结构与光谱的关系 438
三、光吸收的基本规律 439
第二节 分光光度计的结构及类型 442
一、主要结构 442
二、类型 448
1．721型分光光度计 448
2．可见光—紫外光分光光度计 448
第三节 应用 451
一、测定物质的含量 451
二、测定pKa值 458
三、分析物质的结构 459
四、测定动力学常数 461
附录 463
一、常用数据 463
1．常见蛋白质等电点参考值 463
2．常见蛋白质分子量参考值 466
3．一些核酸限制性内切酶裂解入DNA的位点及其数目 469
4．待测溶液和选用滤光片的对应关系表 474
5．颗粒目数与直径（微米）的关系 474
6．重量单位换算表 474
二、常用缓冲液的配制 475
1．乙酸-乙酸钠缓冲液（pH3.6—5.8） 475
2．磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2mol/LpH5.8—8.0） 476
3．Tris—盐酸缓冲液（0.05mol/LpH7.0—9.0） 477
4．硼砂—硼酸缓冲液（0.2mol/L硼酸盐pH7.4—9.0） 478
5．甘氨酸—氢氧化钠缓冲液（pH8.6—10.6） 478
6．广泛缓冲液（pH2.6—12.0） 479
7．巴比妥—盐酸缓冲液（pH6.8—9.6） 480
8．柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液（pH2.6—7.6） 481
9．柠檬酸—柠檬酸、钠缓冲液（pH3.0—6.2） 482
10．氯化钾—氢氧化钠缓冲液（pH12.0—13.0） 483
参考文献 484