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第一章 研究用显微镜技术 1

1.1 研究用显微镜的结构原理 1

1.2 研究用显微镜的光学系统 2

1.2.1 显微镜的基本光学参数 2

1.2.2 光学透镜的象差 3

1.2.3 显微镜的光学系统 4

1.3 研究用显微镜的各类 6

1.3.1 明视场显微镜 6

1.3.2 音视场显微镜 6

1.3.3 相差显微镜 7

1.3.4 微分干涉差显微镜 8

1.3.5 偏光显微镜 10

1.3.6 荧光显微镜 11

1.4 实验 12

1.4.1 明视场显微镜的观察方法 12

1.4.2 相差显微镜的观察方法 13

1.4.3 荧光显微镜的观察方法 14

1.4.4 DNA的光学显微镜结构观察 14

1.4.5 淀粉粒的偏光显微镜观察 15

1.4.6 显微摄影技术 16

1.4.7 显微照片的半自动定量分析 17

思考题 17

参考文献 18

第二章 电子显微术 19

2.1 透射电子显微镜 19

2.1.1 分辨能力和放大倍数 19

2.1.2 电子束及其形成 21

2.1.3 磁透镜 22

2.1.4 图像的反差形成原理 26

2.1.5 透射电子显微镜的仪器结构 27

2.1.6 透射电子显微镜的使用操作 30

2.2 扫描电子显微镜 34

2.2.1 电子与样品的相互作用 34

2.2.2 扫描电子显微镜的成像原理 36

2.2.3 扫描电子显微镜的仪器结构 37

2.2.4 扫描电子显微镜的使用操作 38

2.3 X射线微区分析 39

2.3.1 X射线的产生及其特性 40

2.3.2 X射线的检测 41

2.3.3 X射线微区分析的工作方法 45

2.3.4 X射线微区分析在生物学中的应用 46

2.4 扫描隧道显微镜 47

2.4.1 工作原理 47

2.4.2 在生命科学中的应用 47

2.5.3 扫描电镜的应用 49

2.5.2 不使用超薄切片的电镜技术 49

2.5.1 用透射电镜观察超薄切片 49

2.5 电子显微术在生命科学中的应用实例 49

思考题 50

参考文献 50

附录 50

第三章 超显微结构制样技术 52

3.1 超薄切片技术 52

3.1.1 取材 53

3.1.2 固定 54

3.1.3 漂洗与脱水 59

3.1.4 渗透、包埋与聚合 60

3.1.5 超薄切片 63

3.1.6 超薄切片的染色 65

3.2 实验 67

3.2.1 Formvar支持膜的制备 67

3.2.2 动物样品包埋块的制备 68

3.2.3 植物样品包埋块的制备 69

3.2.4 超薄切片 71

3.2.5 超薄切片的染色 73

3.2.6 半薄切片的染色 75

3.3 负染色技术 77

3.3.1 常用的负染色液 77

3.3.3 负染色应注意的问题 78

3.3.2 染色方法 78

3.4 分子生物学电镜制样技术 80

3.4.1 核酸大分子电镜制样技术 80

3.4.2 蛋白质大分子电镜制样技术 85

3.4.3 多糖大分子电镜制样技术 86

3.5 电子显微镜细胞化学技术 87

3.5.1 基本原理 87

3.5.2 三磷酸腺苷酶(ATPase) 88

3.5.3 酸性磷酸酶(ACP) 89

3.5.4 碱性磷酸酶(ALP) 90

3.5.5 琥珀酸脱氢酶(SDH) 91

3.5.6 葡萄糖-6-磷酸酶 93

3.5.7 髓过氧化物酶 94

3.6 电镜放射自显影技术 95

3.6.1 原理 95

3.6.2 材料与仪器设备 97

3.6.3 实验步骤 97

3.7 冷冻复型技术 101

3.7.1 原理 101

3.7.2 仪器设备及药品 102

3.7.3 实验步骤 103

3.7.4 冷冻蚀刻复型图像的辨认 106

3.8 免疫电镜胶体金标记法 107

3.8.1 基本原理 107

3.8.2 实验程序 108

3.8.3 电镜水平的免疫染色 111

3.9 核酸分子杂交技术 115

3.9.1 基本原理 115

3.9.2 试剂和器具 116

3.9.3 rDNA探针的制备和标记 116

3.9.4 原位杂交及杂交子的检测 118

3.10 扫描电镜样品制备技术 119

3.10.1 基本原理 119

3.10.2 扫描电镜的活体样品的制备 121

3.10.3 孢子、花粉等少水样品的制备 121

3.10.4 扫描电镜一般生物样品制备方法--ODO-导电染色法 121

参考文献 123

思考题 123

附录1 仪器操作步骤 124

附录2 缓冲液 125

附录3 固定液 127

附录4 其它 129

第四章 超离心技术 130

4.1 基本原理 130

4.1.1 离心力 130

4.1.2 沉降系数 131

4.1.3 沉降时间 133

4.2.1 高速离心机 134

4.1.4 沉降速度 134

4.2 离心机的种类和基本结构 134

4.2.2 制备性超速离心机 135

4.2.3 分析性超速离心机 136

4.3 超离心法 137

4.3.1 差速离心法 137

4.3.2 密度梯度离心法 137

4.3.3 等密度梯度离心法 139

4.3.4 密度梯度的制备和收集 139

4.4.1 分子量的测定 142

4.4.2 未知DNA样品密度的测定 142

4.4 超速离心在生物学中的应用 142

4.4.3 从密度推算DNA的G-C碱基含量 143

4.4.4 检测生物大分子中构象的变化 143

4.5 实验 144

4.5.1 大鼠肝线粒体的分离 144

4.5.2 大鼠肝细胞核的分离 145

4.5.3 氯化钠密度梯度纯化质粒DNA 146

4.5.4 氯化铯等密度梯度超离心纯化质粒DNa 147

思考题 150

参考文献 151

附录1 离心机的操作规程 151

附录3 离心机转数(rpm)与相对离心力(RCF)的换算 153

第五章 紫外-可见分光光度法 155

5.1 基本知识 155

5.1.1 紫外-可见光吸收光谱的本质 155

5.1.2 Lambert-Beer定律 156

5.1.3 吸收定律的正确应用 157

附录2 DGF-U型密度梯度形成仪操作规程 158

5.2 分光光度计的一般结构 160

5.3 紫外-可见分光光度计的特殊装置 162

5.3.1 扫描装置的设计原理 162

5.3.3 双光束分光光度计的光路设计 163

5.3.4 双波长分光光度计的光路设计 163

5.3.2 斩波器 163

5.4 分光光度法 164

5.4.1 定性分析 164

5.4.2 定量分析 165

5.5 生物大分子的光学特性 167

5.5.1 蛋白质的光学特性 167

5.5.2 核酸的光学特性 168

5.6 实验 168

5.6.1 单色器的分光效应 168

5.6.2 高锰酸钾的可见光谱 169

5.6.3 蛋白质和DNA的紫外吸收光谱 170

5.6.4 蛋白质的微分光谱 170

5.6.5 苹果酸脱氢酶(MDH)的测定 172

5.6.6 不同组织苹果酸脱氢酶km值的测定 173

5.6.7 心骨、骨骼肌线粒体内膜ATPase的测定 174

5.6.8 DNA的Tm值测定 174

5.6.9 DNA中A-T碱基含量的紫外分析法 175

5.6.10 烟酸的光谱测定 176

5.6.11 豆类球蛋白的定量分析 178

5.6.12 豆类醇溶蛋白的定量分析 179

5.6.13 维生素D的测定 180

5.6.14 豆类种子β-胡萝卜素的测定 182

思考题 184

参考文献 184

6.1.1 分子的主要振动类型--伸展振动和弯曲振动 185

第六章 红外分光光度法 185

6.1 基本知识 185

6.1.2 吸收带的位置和强度 186

6.1.3 吸收峰的表示方法 187

6.1.4 几种常用术语 187

6.2 基本结构 187

6.2.1 干涉仪原理 188

6.2.2 付里叶转换 189

6.3 红外光谱分析的试样制备方法 190

6.4 实验 191

6.4.1 试样制备技术 191

6.4.2 蛋白质的红外光谱分析 192

6.4.3 多糖分子的红外光谱分析 193

6.4.5 毛纤维的红外光谱分析 194

6.4.4 脂溶性维生素的红外光谱分析 194

6.4.6 红外光谱法在基因探测中的应用 195

思考题 196

参考文献 196

附录 5DX付里叶转换红外分光光度计 197

第七章 荧光分光光度法 201

7.1 荧光分析的基本知识 201

7.1.1 荧光的产生 201

7.1.2 荧光量子产率 201

7.1.5 相对荧光量子效率 202

7.1.3 荧光强度 202

7.1.4 荧光偏振 202

7.2 荧光分光光度计的基本结构 204

7.3 荧光分析的影响因素及注意事项 204

7.3.1 温度对荧光的影响 204

7.3.2 pH的影响 204

7.3.3 溶剂的影响 204

7.3.4 荧光的消退 204

7.3.5 防止污染 204

7.4 生物样品的荧光分析 204

7.4.1 维生素B1的测定 206

7.4.2 维生素B2的测定 208

7.4.3 维生素C的测定 209

7.4.4 维生素E的测定 211

7.4.5 微量元素硒的测定 213

7.4.6 蛋白质的测定 215

7.4.7 肌肉中乳酸脱氢酶的测定 216

7.4.8 毫微克DNA的测定 217

7.4.9 单个细胞核DNA的测定 218

7.4.10 线粒体质膜流动性的测定 218

思考题 219

参考文献 220

附录 RF-540荧光分光光度计的性能和操作方法 220

8.1.1 原子吸收光谱的产生 221

第八章 原子吸收光谱分析技术 221

8.1 基本原理 221

8.1.2 原子谱线的轮廓与变宽 222

8.1.3 吸收定律 224

8.2 仪器结构 225

8.2.1 光源 226

8.2.2 原子化器 226

8.2.3 单色器 227

8.2.4 检测器和读出系统 227

8.3 分析方法 228

8.3.1 原子吸收光谱分析中的干扰及其消除 228

8.3.2 分析方法 230

8.3.3 灵敏度和检出限 232

8.4 实验 233

8.4.1 苹果中钙储量的测定 233

8.4.2 血清中镁含量的测定 234

8.4.3 头发中铅含量的测定 235

8.4.4 食用豆中微量元素铁、锰、锌含量的测定 236

8.4.5 食用豆中微量元素铜、镍含量的测定 237

思考题 238

参考文献 239

附录1 塞曼原子吸收法的主要吸收线和原子吸收相对灵敏度 239

附录2 日立180-80型偏振塞曼原子吸收分光光度计操作规程 241

9.1 显得分光光度法测定原理 246

第九章 扫描显微分光光度法 246

9.2 显微光度计扫描测定的基本原理 247

9.3 扫描显微分光光度计的基本结构 247

9.3.1 显微镜 248

9.3.2 光度计 248

9.3.3 扫描系统 249

9.3.4 自动控制系统 249

9.4 显微光度法的应用实例 250

9.4.1 细胞容积的测定 250

9.4.2 剧烈运动前后细胞内酶的显微定量分析 251

9.4.3 染色体的核型分析 253

9.4.4 人染色体脆性位点的测定 254

9.4.5 染色体带纹的定量分析 256

9.4.6 核DNA的显微荧光定量分析 261

9.4.7 鱼三倍体DNA孚尔根测定方法 262

9.4.8 染色体DNA的显微荧光定量分析 263

9.4.9 毛纤维的荧光测定 264

思考题 264

参考文献 265

附录 Univar扫描显微分光光度计的及操作方法 265

第十章 气相色谱技术 267

10.1 基本原理 267

10.1.1 概述 267

10.1.2 气相色谱的分析过程 268

10.2 气相色谱仪的基本结构 269

10.2.1 气相色谱填充柱 269

10.2.2 毛细管色谱柱 271

10.2.3 检测器 272

10.3 气相色谱分析方法 274

10.3.1 操作条件的选择 274

10.3.2 定性和定量方法 275

10.4 实验 277

10.4.1 食用豆类脂肪酸的气相色谱分离和测定 277

10.4.2 植物激素脱落酸的毛细管色谱分离和测定 279

10.4.3 微生物胞外多糖的毛细管色谱分离和测定 281

10.4.4 玉米暝昆虫激素的气相色谱分离和测定 282

10.4.5 酒精发酵液乙醇含量的气相色谱分析 283

10.4.6 食用豆类磺的测定 284

10.4.7 丁醇的气相色谱分析 286

10.4.8 植物材料释放乙烯的气相色谱分离和测定 288

思考题 289

参考文献 289

附录1 岛津GC-7A气相色谱仪的操作方法 289

附录2 实验室常用固定液 293

附录3 不同温度下水的饱和蒸气压 294

附录4 不同进出口压力时的压力校正值j 294

附录5 标准筛的规格 295

第十一章 高效液相色谱分离分析技术 296

11.1 概述 296

11.2 HPLC的类型及其分离的基本原理 296

11.2.1 液-固色谱 296

11.2.2 液-液色谱和键合相色谱 297

11.2.3 离子交换色谱 298

11.2.4 排斥色谱(凝胶色谱) 298

11.3 高效液相色谱仪的结构 299

11.3.1 储液瓶 299

11.3.2 高压输液泵 300

11.3.3 进样系统 300

11.3.5 检测器 301

11.3.4 色谱柱 301

11.4 实验 302

11.4.1 单核苷酸的分离分析 302

11.4.2 可溶性糖的定量分析 303

11.4.3 氨基酸的分离分析技术 304

思考题 306

参考文献 307

附录1 岛津LC-4A高效液相色谱仪的结构与操作 307

附录2 氨基酸分析的预处理技术 310

12.1 仪器结构原理 317

12.1.1 测定原理 317

第十二章 薄层色谱扫描仪 317

12.1.2 仪器结构 318

12.2 扫描方法 321

12.3 实验 322

12.3.1 线性扫描操作技术 322

12.3.2 锯齿扫描操作技术 322

12.3.3 微量核酸样品的定量分析 323

12.3.4 同功酶的定量分析 323

思考题 324

参考文献 325

附录1 CS-910双波长薄层色谱扫描仪的性能与操作 325

附录2 C-RIB的定量分析方法 327

13.1 基本原理 329

第十三章 等电聚焦凝胶电泳技术 329

13.2.1 平床电泳仪 331

13.2.2 与平床电泳仪配套的装置 331

13.2 仪器结构 331

13.3 聚丙烯酰胺(PAA)凝胶 332

13.3.1 聚丙烯酰胺凝胶的结构和聚合 332

13.3.2 聚丙烯酰胺凝胶浓度和交联度 333

13.3.3 聚丙烯酰胺凝胶的制备 334

13.3.4 凝胶板的制备 335

13.3.5 凝胶板的放置 335

13.3.6 电泳操作 335

13.3.8 加样 336

13.3.7 预聚焦 336

13.3.9 电泳 337

13.3.10 固定与染色 337

13.4 实验 338

思考题 340

参考文献 340

附录 多用电泳仪的结构和操作要点 340

第十四章 交变脉冲电场凝胶电泳 346

14.1 原理 346

14.2 交变脉冲电泳装置的类型 346

14.2.1 正交交变电场凝胶电泳 346

14.2.2 箝形均匀电场电流 347

14.2.3 旋转凝胶电泳 348

14.2.4 倒转电场凝胶电泳 348

14.3 影响PFGE分离的因素 348

14.3.1 脉冲时间的影响 348

14.3.2 分子大小、电场强度和温度的影响 348

14.3.3 电场间角度的影响 349

14.4 分子陷阱 349

14.5 分子泳动的机制 350

14.5.1 常规电泳的分子机制 350

14.5.2 FIGE分离过程的分子机制 350

14.5.3 分子在OFAGE中的重新定向机制 350

14.5.4 巨大分子的泳动 351

14.6 带宽和分辨率 352

14.7 脉冲电泳方法 352

14.7.1 样品制备 352

14.7.2 DNA的标准品 352

14.7.3 电泳方法 353

14.8 应用实例 353

14.8.1 酵母染色体OFAGE的分离 353

14.8.2 棉病囊霉的电泳核型分析 354

14.8.3 小麦、大麦、黑麦大分子量的DNA的脉冲电泳分离 355

14.8.4 水稻大分子DNA的脉冲电泳分离 355

参考文献 356