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前言 1

第1章 研究显微镜与显微图像分析技术 1

1.1 普通光学显微镜的构造和使用 1

1.2 倒置相差显微镜的原理及使用 6

1.3 荧光显微镜的原理及使用 7

1.4 激光扫描共聚焦显微镜技术 11

1.5 显微操作技术 17

1.5.1 体细胞显微注射技术 18

1.5.2 受精卵显微注射技术 20

1.6 活细胞荧光显微成像技术 26

1.7 细胞显微图像分析技术 29

第2章 电镜技术 35

2.1 透射电镜 35

2.2 TEM样品制备技术 38

2.2.1 TEM超薄切片技术 38

2.2.2 TEM负染色技术 44

2.2.3 TEM细胞化学技术 46

2.2.4 石蜡组织与石蜡切片的TEM样品制备 63

2.3 扫描电子显微镜 64

2.4 SEM样品制备 66

2.4.1 常规SEM生物样品制备 66

2.4.2 SEM游离细胞制备 68

2.4.3 SEM免疫细胞化学技术 71

第3章 细胞化学技术 74

3.1 普通细胞化学 74

3.1.1 细胞化学理论知识 74

3.1.2 PAS（periodic acid Schiff reaction）法显示糖原 77

3.1.3 苏丹染色法显示脂类 80

3.1.4 酸性蛋白与碱性蛋白的显示 81

3.1.5 细胞骨架微丝蛋白的显示 82

3.1.6 Feulgen法显示核酸 84

3.1.7 甲基绿-派洛咛法显示核酸 85

3.1.8 Giemsa染色法显示染色质/体 86

3.1.9 苏木精-伊红染色显示细胞核和细胞质 87

3.2 酶细胞化学 89

3.2.1 酶细胞化学的基本理论 89

3.2.2 碱性磷酸酶显示 91

3.2.3 金属沉淀法显示酸性磷酸酶 93

3.2.4 联苯胺法显示过氧化物酶 95

3.2.5 通过琥珀酸脱氢酶活性进行MTT法检测细胞相对存活率 95

3.3 免疫细胞化学 97

用ABC方法来鉴定体外培养的小鼠星形胶质细胞 98

3.4 荧光细胞化学与免疫荧光细胞化学 100

3.4.1 吖啶橙荧光染色法 103

3.4.2 间接免疫荧光细胞化学法显示细胞中的微管蛋白 105

3.4.3 用双重免疫荧光标记法鉴定体外培养的小鼠神经元和神经胶质细胞 106

3.4.4 用双重免疫荧光法鉴定组织切片中的两种细胞的方法 108

第4章 细胞培养技术 111

4.1 细胞培养的基本原理与技术 111

4.1.1 细胞在体外生长的条件 111

4.1.2 培养细胞常用设备和用品 113

4.1.3 培养用品的清洗 116

4.1.4 培养用品的灭菌与消毒 118

4.1.5 无菌操作的基本要领和要求 119

4.1.6 细胞培养用液 120

4.2 细胞培养的方法 126

4.2.1 原代细胞培养 126

4.2.2 细胞传代培养 129

4.3 体外培养细胞的观察方法 131

4.3.1 培养细胞的生长特征与形态分型 131

4.3.2 培养细胞固定、染色观察的一般标本制备 135

4.3.3 细胞计数方法 137

4.3.4 细胞的显微测量 138

4.4 培养细胞的冻存、复苏与运输 140

4.5 培养细胞增殖动力学方法 142

4.5.1 生长曲线的测定 142

4.5.2 分裂指数测定 143

4.5.3 克隆（集落）形成试验 144

4.5.4 BrdU掺入法测定细胞增殖指数 145

4.6 肿瘤细胞黏附和侵袭能力的体外检测方法 147

4.6.1 肿瘤细胞的黏附能力分析实验 148

4.6.2 细胞侵袭重建基底膜实验 149

4.6.3 肿瘤细胞迁移实验 151

4.7 哺乳动物正常组织细胞的体外培养与应用 153

4.7.1 胎鼠大脑皮层神经细胞的原代培养方法 153

4.7.2 含药血清对体外培养细胞的药理实验 155

4.7.3 四氯化碳致肝细胞损伤及SOD活性检测 158

第5章 培养细胞凋亡检测技术 162

5.1 光学显微镜形态学检测 162

5.1.1 台盼蓝染色法显示凋亡细胞 164

5.1.2 苏木精-伊红染色（HE染色）显示凋亡细胞 164

5.1.3 Giemsa染色法显示凋亡细胞 166

5.1.4 吖啶橙荧光染色显示凋亡细胞 167

5.1.5 Ho.33342与PI荧光双染显示凋亡与坏死细胞 168

5.2 凋亡细胞的超微结构观察 169

5.2.1 透射电镜观察凋亡细胞 169

5.2.2 扫描电镜观察凋亡细胞 170

5.3 凋亡细胞琥珀酸脱氢酶活性检测（MTT法） 171

5.4 DNA电泳检测凋亡梯状带 172

5.5 细胞膜磷脂酰丝氨酸荧光显示 173

5.6 凋亡细胞原位末端标记 174

第6章 细胞工程 178

6.1 细胞融合 178

6.1.1 聚乙二醇介导的细胞融合 178

6.1.2 细胞电融合 181

6.1.3 早熟染色体凝集的诱导和观察 184

6.2 细胞的分离 187

6.2.1 淋巴细胞的分离纯化 187

6.2.2 死活细胞的分离 188

6.3 细胞器的分离 189

第7章 原位杂交技术 192

7.1 地高辛标记的原位杂交 193

7.2 放射性同位素标记的原位杂交 196

7.3 胚胎整体原位杂交 198

第8章 细胞化学成分的分离与测定 206

8.1 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳 206

8.2 真核细胞基因组DNA的提取 207

8.3 真核细胞RNA的提取 209

8.4 免疫沉淀法分离并定量分析目的蛋白质 211

8.5 蛋白质免疫印迹法 213

8.6 蛋白质双向电泳分析细胞和组织中的蛋白质群 215

第9章 真核细胞基因转染与表达技术 224

9.1 DNA转染技术 224

9.1.1 磷酸钙转染技术 224

9.1.2 脂质体转染技术 226

9.2 基因在细胞中表达的检测技术 227

9.2.1 DNA印迹杂交法 227

9.2.2 RNA印迹杂交法 230

9.2.3 蛋白印迹杂交法 233

9.2.4 绿色荧光蛋白基因转染及检测 235

第10章 哺乳动物基因敲除技术 237

10.1 常用基因打靶载体的设计原则 237

10.1.1 P21（WAF1）基因打靶载体的构建 237

10.1.2 C-Crk基因打靶载体的构建 239

10.1.3 视黄醇脱氢酶RDH15基因打靶载体的构建 241

10.2 胚胎干细胞基因敲除 243

10.2.1 胚胎干细胞的增殖和维持 243

10.2.2 胚胎干细胞标准电穿孔 246

10.2.3 鉴定、筛选重组的胚胎干细胞 247

10.3 嵌合体小鼠的制备 248

10.3.1 嵌合体小鼠的产生 249

10.3.2 GPI同工酶的水平淀粉凝胶电泳检测嵌合体小鼠 252

10.4 基因敲除小鼠的建立 253

10.4.1 提取鼠尾DNA用PCR来检测敲除基因 253

第11章 干细胞和组织工程技术 256

11.1 胚胎干细胞培养技术与方法 256

11.1.1 小鼠胚胎干细胞的分离、培养及诱导分化 256

11.1.2 人胚胎干细胞的分离和培养 263

11.1.3 人类胚胎干细胞定向分化成神经细胞 268

11.2 成体干细胞培养技术与方法 272

11.2.1 成人骨髓基质干细胞培养、纯化及鉴定 272

11.2.2 人造血干/祖细胞的体外培养与检测技术 275

11.2.3 大鼠胚胎脑神经干细胞和祖细胞的分离培养 283

11.3 神经组织工程 287

第12章 流式细胞术 294

12.1 流式细胞仪的结构、工作原理及应用 294

12.2 流式细胞仪检测细胞膜受体（直标法） 297

12.3 流式细胞仪同时检测细胞内和细胞外抗原 298

12.4 流式细胞仪检测细胞凋亡（PI单染色法） 299

12.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死（PI和Annexin V-FITC双染色法） 301

12.6 流式细胞仪检测凋亡细胞内游离钙离子浓度变化 303