PCR（聚合酶链反应）PDF电子书下载

原理篇 3

第1章 PCR技术基本原理 3

1.1 基本原理 3

1.2 PCR反应动力学 5

1.3 PCR技术的特点 6

1.4 PCR反应体系的组成 6

1.5 PCR所需设备和器材 9

参考文献 9

第2章 PCR技术的发展 11

2.1 PCR新技术的发展 11

2.2 其他核酸扩增技术的发展 15

参考文献 18

第3章 PCR技术在医学研究领域中的应用 19

3.1 PCR在医学检验中的应用 19

3.2 对PCR技术医学应用的正确认识 21

3.3 PCR技术在医学应用中的管理 22

参考文献 23

操作方法／技术篇 27

第4章 常规PCR 27

4.1 常规PCR反应体系说明 27

4.2 PCR操作 27

4.3 PCR条件优化 48

参考文献 55

第5章 反转录PCR 57

5.1 RT-PCR原理 57

5.2 RNA的提取和纯化 60

5.3 RT-PCR的操作 66

5.4 衍生技术——基因表达系列分析 82

参考文献 85

第6章 实时荧光定量PCR 87

6.1 原理 87

6.2 实验操作与优化 89

6.3 实时定量PCR数据分析 93

6.4 qPCR的常用软件——Primer Express 99

6.5 qPCR仪的选择 107

参考文献 112

第7章 免疫PCR 115

7.1 原理 115

7.2 实验操作 121

7.3 条件优化 125

参考文献 128

第8章 利用PCR构建突变体 131

8.1 定点突变 131

8.2 随机诱变PCR 144

8.3 衍生技术 147

参考文献 155

第9章 未知序列的克隆 157

9.1 RNA连接酶介导的cDNA 5′末端快速扩增 157

9.2 单侧特异性引物扩增未知DNA序列 161

9.3 反向PCR 163

参考文献 166

第10章 其他医学领域常见PCR技术 167

10.1 PCR技术应用于病原微生物检测鉴定 167

10.2 遗传性疾病诊断的常用PCR技术 175

10.3 PCR技术在肿瘤方面的应用 182

10.4 甲基化特异性PCR 186

参考文献 193

第11章 PCR软件使用 195

11.1 Oligo 6的使用 197

11.2 PerlPrimer的使用 206

11.3 引物在线设计 210

常见问题解答 215

1 为什么完全没有PCR扩增产物？ 215

2 为什么除目的条带外，还出现多条非特异扩增条带？ 215

3 为什么目的条带未出现但有非特异扩增条带出现？ 216

4 为什么PCR产物很少？ 216

5 为什么同一批PCR反应中包括阴性对照在内的平行管出现相同的阳性结果？ 216

6 为什么PCR产物出现片状拖带或涂抹带？ 216

7 如何提高PCR的保真度？ 217

8 如何减少PCR污染？ 217

9 如何特异扩增极微量的目的基因片段？ 217

10 如何确定最适退火温度？ 217

11 如何进行长片段PCR扩增？ 218

12 如何提高PCR的特异性？ 219

13 RNA制备过程中如何避免RNase污染？ 219

14 进行RNA相关实验时，塑料制品、玻璃和金属物品需要怎么处理？ 219

15 什么时候需要分离mRNA？ 220

16 如何判定分离的总RNA的纯度？ 220

17 提取RNA时什么时候需要加入RNA载体？ 220

18 如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA？ 220

19 纯化的RNA样品如何保存？ 220

20 组织和细胞样品如何收集和保存？ 220

21 如何估计RNA的产量？ 220

22 RNA制备过程中哪个环节要特别注意？ 221

23 RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？ 221

24 RT-PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？ 221

25 如何选择RT-PCR的方法？ 221

26 RT-PCR的常用内标β-actin和GAPDH的使用是否有选择性，比如不同的细胞、不同的刺激？ 221

27 如何确定PCR的线性期？ 222

28 引物的特异退火温度怎样设定？是否可以根据GC和AT含量算出？是否可以用引物报告单上的Tm值？ 222

29 PCR时20μL体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？20μL是指体积还是量？ 222

30 PCR结果进行电泳，actin有，但无其他目的条带，有几种原因？是否与cDNA的量少有关？Mg2＋太多是否会抑制Taq酶的活性？ 223

31 RT-PCR的引物如何设计？ 223

32 如何确认RNA的质量？ 224

33 RT-PCR中的定量如何控制？ 225

34 RT-PCR的实验设计需注意哪些事项？ 225

35 RT-PCR结果可以代替蛋白表达的结果吗？ 226

36 DNA残留是否会影响RT-PCR？ 226

37 RT-PCR定量测定中产物长度是否有限制？ 226

38 RT-PCR中内参照的意义是什么？ 226

39 RT-PCR中应选择什么作为内参照？ 226

40 RT-PCR定量实验中的凝胶成像要注意什么？ 226

41 提取RNA时沉淀RNA步骤要注意什么？ 227

42 RNA的保存要注意什么？ 227

43 从临床样品中提取RNA有哪些注意事项？ 227

44 PCR基因诱变的意义是什么？ 227

45 定点突变时，转化率低或仅能得到很少菌落怎么办？ 227

46 怎么解决定点突变中低突变率的问题？ 228

47 如何避免PCR定点诱变中出现的假阳性问题？ 228

48 怎样控制PCR随机基因突变的突变率？ 228

49 在随机突变PCR后，看不到目的DNA产物条带怎么办？ 228

50 QF-PCR实验中无CT值（信号）出现是什么原因？ 229

51 QF-PCR中CT值出现过晚是什么原因？ 229

52 QF-PCR中标准曲线的线性关系不佳是什么原因？ 229

53 QF-PCR中阴性对照也出现明显的扩增是什么原因？ 230

54 QF-PCR中熔解曲线不止一个主峰是什么原因？ 230

55 QF-PCR中扩增效率低是什么原因？ 230

56 QF-PCR中实验重复性不好是什么原因？ 230

57 如何知道QF-PCR中变性温度是否合适？ 230

58 QF-PCR中如何选择变性时间？ 230

59 QF-PCR中如何知道退火温度和时间是否合适？ 231

60 QF-PCR中应该在哪一步读取荧光信号？ 231

61 与常规的5'-RACE相比，RML-RACE有什么特点？ 231

62 IPCR的主要用途是什么？ 231

63 PCR-SSCP实验中有哪些注意事项？ 232

64 如何优化多重PCR反应？ 233

65 原位PCR要注意哪些问题？ 234

66 PCR测序实验要注意哪些事项？ 236

67 MSP与常规PCR有何不同？ 236

68 为何有些组织DNA样品在MSP中同时出现甲基化和非甲基化两种结果？ 236

69 MSP中如何设置对照？ 236

70 采用软件设计的引物是否一定比自己根据经验设计的引物好？ 237

附录 241

附录1 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 241

附录2 临床基因扩增检验实验室基本设置标准 245

附录3 临床基因扩增检验实验室工作规范 247