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概述 1

一、基因工程 1

二、基因工程的发展历程 3

三、基因工程研究现状及发展趋势 3

上篇 动物基因工程的分子生物学基础 7

第一章 动物基因的结构与组合 7

第一节 动物基因的分子结构 7

一、DNA的碱基组成 8

二、DNA的一级结构 8

三、DNA的二级结构 9

四、染色体 11

第二节 动物基因的重复序列 12

一、动物基因的重复序列 13

二、动物DNA重复序列的组织形式 14

第三节 动物基因的组织形式 16

一、动物基因的不连续性 17

二、基因家族和基因簇 22

三、串联重复基因 22

四、侧翼序列 22

第四节 基因及基因组的大小 29

一、动物基因的大小 29

二、动物基因组的大小 30

第五节 线粒体基因组 31

第二章 DNA复制 34

第一节 DNA复制机制 35

一、半保留复制 35

二、θ方式和滚环方式 37

第二节 DNA的复制过程 39

一、复制的起始和方向 39

二、DNA双螺旋的解开 39

三、RNA引物的合成 40

四、半不连续复制 40

五、引发和引发体 41

六、链的延伸 44

七、链的终止 44

八、复制的忠实性 45

第三节 动物染色体DNA复制 46

一、动物DNA复制起始点与起始 46

二、延伸 47

三、复制终止 47

四、端粒的复制 47

第三章 动物基因的转录及转录水平的调控 49

第一节 转录的机制 49

一、转录起始 50

二、转录的延伸 53

三、转录终止 54

第二节 基因转录产物的后加工 57

一、rRNA的转录后加工 57

二、tRNA的转录后加工 58

三、mRNA的转录与后加工 58

第三节 真核基因转录水平的调控 67

一、基因结构的活化 68

二、转录起始的调控 71

三、转录过程的调控 75

第四章 蛋白质的生物合成及翻译水平的调控 76

第一节 遗传密码 76

第二节 tRNA及其功能 78

第三节 核糖体的结构和装配 80

第四节 真核生物蛋白质的合成 81

一、原核生物蛋白质生物合成机制 82

二、真核生物蛋白质的生物合成 87

第五节 蛋白质翻译初始产物的修饰 91

第六节 翻译水平的调控 93

一、翻译因子磷酸化调控 95

二、转铁蛋白mRNA翻译的调控模式 96

下篇 动物基因工程操作 97

第五章 基因工程中的常用技术 97

第一节 凝胶电泳技术 97

一、凝胶电泳的基本原理 97

二、琼脂糖凝胶电泳 98

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 104

第二节 核酸分子杂交技术 107

一、放射性同位素标记的DNA探针的制备 108

二、待测核酸的处理 109

三、杂交及杂交后漂洗 110

四、自显影 110

第三节 细菌转化 116

第四节 DNA核苷酸序列分析技术 117

一、Sanger双脱氧链终止法 117

二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法 118

第五节 PCR扩增技术 119

一、基本原理 119

二、PCR的设计和参数 120

三、PCR技术的应用 126

第六章 基因工程常用的酶类 128

第一节 限制性核酸内切酶和DNA分子的体外切割 128

一、Ⅱ类限制性内切酶的基本特点 128

二、限制性内切酶的来源及命名 133

三、影响限制性内切酶活性的因素 133

四、限制性内切酶酶切图谱分析 134

第二节 DNA连接酶与DNA分子的体外连接 135

一、DNA连接酶 135

二、DNA的连接方法 136

第三节 DNA聚合酶及其在基因工程中的应用 136

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶） 137

二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 138

三、T4噬菌体DNA聚合酶 138

四、T7噬菌体DNA聚合酶 139

五、经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 139

六、Taq DNA聚合酶及Ampli TaqTM DNA聚合酶 139

七、反转录酶（依赖于RNA的 DNA聚合酶） 140

八、末端转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶） 141

第四节 核酸外切酶及核酸内切酶 141

一、核酸外切酶 141

二、核酸内切酶 142

第五节 其他DNA和RNA的修饰酶及其应用 143

第七章 基因工程的载体和宿主表达系统 144

第一节 细菌质粒载体 144

一、质粒的基本特性 145

二、不同用途的细菌质粒载体 146

第二节 噬菌体载体 152

一、λ噬菌体 153

二、M13噬菌体 154

第三节 酵母系统载体 155

一、酵母整合质粒 156

二、酵母复制子质粒 156

三、酵母游离基因载体 157

第四节 动物病毒载体 157

一、病毒颗粒载体 157

二、病毒DNA混合型载体 159

第五节 原核细胞表达系统 161

一、影响真核基因在大肠杆菌中表达的主要因素 162

二、外源基因在大肠杆菌细胞内表达重组蛋白 164

三、重组蛋白分泌到周质 166

四、重组蛋白分泌到胞外培养基中 168

第六节 真核细胞表达系统 169

一、酵母表达系统 169

二、哺乳动物细胞表达系统 173

第七节 个体表达系统 176

第八章 基因工程的基本操作程序 177

第一节 基因工程的基本程序 177

第二节 DNA体外重组和扩增 178

一、目的基因的制备和载体基因的选择与改造 178

二、目的DNA片段与载体DNA体外重组 184

三、重组子的扩增 189

第三节 重组DNA分子的选择与鉴定 190

一、抗性选择 190

二、从转化菌落快速提取质粒鉴定大小选择重组质粒 191

三、快速提取质粒进行酶切鉴定 192

四、菌落杂交法挑选重组质粒 194

五、DNA的序列分析 195

第四节 重组DNA的表达与表达产物的检测 195

一、磷酸钙和DNA共沉淀物的转染 197

二、改进的磷酸钙介导细胞转染法 199

三、DEAE-葡聚糖介导的转染 200

四、利用聚阳离子介导的DNA转染 202

五、利用原生质体融合进行DNA转染 203

六、电穿孔法DNA转染 204

七、重组DNA表达及表达产物的检测与分析 205

第九章 转基因动物 206

第一节 转基因的设计和制备 206

一、转基因及转基因的设计 206

二、转基因的制备 211

三、影响基因转移的因素 213

四、动物转基因的效率 214

五、动物转基因的表达特性 214

六、动物转基因的生物学效应 215

第二节 显微注射法制备转基因动物 216

一、转基因鼠的制备 216

二、转基因羊的制备 231

三、显微注射生产转基因牛 233

第三节 转基因动物的检测 237

一、DNA整合水平的检测 239

二、RNA转录水平的检测 245

三、蛋白质水平的表达检测 247

第四节 转基因动物品系的建立 252

一、纯合子转基因动物的鉴定 253

二、转基因拷贝数的测定 253

三、转基因表达产物或表型的定量 254

四、分裂间期核的原位杂交 254

五、试繁殖 254

六、应用侧翼序列探针的Southern blot检测 254

七、RT-PCR检测 255

第五节 培育转基因动物的其他方法 255

一、胚胎干细胞介导的转基因 255

二、逆转录病毒介导的转基因 255

三、精子载体介导的转基因 256

第六节 动物乳腺生物反应器 257

一、动物乳腺是外源蛋白质合成的首选器官 257

二、乳腺定位表达载体的构建策略 258

三、目的基因的选择 259

第七节 转基因动物的应用及前景 260

第十章 动物细胞工程 264

第一节 动物细胞的培养 265

一、培养细胞的起源和特征 265

二、动物细胞培养的基本技术 266

第二节 细胞融合与重组 274

一、细胞融合的基本技术 275

二、融合后杂种细胞的筛选 276

三、融合细胞的特征及应用 277

第三节 单克隆抗体制备技术 281

一、制备单克隆抗体的基本原理与程序 281

二、单克隆抗体的应用 284

第四节 染色体转移 284

一、微细胞介导的基因转移法 285

二、染色体介导的基因转移法 286

第五节 DNA介导的基因转移 289

一、基因导入细胞的途径 289

二、转化细胞的选择 290

三、外源基因在哺乳动物细胞中的表达 290

四、DNA介导的基因转移的应用 291

第六节 核移植技术 292

一、低等动物的核移植 292

二、哺乳动物的核移植 293

第七节 胚胎干细胞简介 293

一、胚胎干细胞的基体特征 293

二、胚胎干细胞的分离和培养 294

三、胚胎干细胞的个体发育 294

第十一章 动物基因治疗与基因免疫 295

第一节 基因治疗及其基本程序 295

一、基因治疗的基本概念 295

二、基因治疗的分子机制 296

三、基因治疗的基本程序 296

第二节 基因治疗的载体构建 297

一、目的基因 297

二、基因治疗的载体构建 298

第三节 基因治疗的基因转移方式 302

一、直接注射法 302

二、外源基因体外转移后返回体内 303

三、呼吸道气溶胶法 304

四、基因枪粒子轰击基因转移技术 304

第四节 疾病的基因治疗 304

一、遗传病的基因治疗 305

二、肿瘤性疾病的基因治疗 305

三、病毒病的基因治疗 307

四、基因治疗的副反应及其对策 307

第五节 基因免疫 308

一、基因疫苗的概念 308

二、基因疫苗的特点 309

三、基因疫苗的免疫机制 310

四、基因疫苗的抗原呈递 310

五、基因疫苗的免疫途径 312

第六节 基因疫苗载体的构建与表达检测 313

一、基因疫苗抗原基因 313

二、用于构建基因疫苗的载体 315

三、重组质粒在体外真核细胞中的表达与检测 315

四、基因疫苗制备 316

第七节 基因疫苗免疫方法 316

一、肌肉注射法 317

二、皮内注射法 319

三、静脉注射法 320

四、黏膜免疫法 320

五、基因枪法 321

六、基因疫苗的免疫剂量和免疫次数 321

七、基因疫苗免疫效果检测 322

第八节 影响基因疫苗免疫效果的因素 323

一、载体构件对基因疫苗免疫效果的影响 323

二、接种方法对免疫效果的影响 325

三、免疫佐剂和辅佐分子的作用 325

四、个体差异对基因免疫效果的影响 327

第九节 基因疫苗的安全性 327

一、局部反应和全身毒性评定 328

二、遗传毒性评定 328

三、生殖毒性评定 329

四、肿瘤发生评定 329

英文缩写 330

主要参考文献 333